一株傳染性胰腺壞死病毒基因組序列分析及反向遺傳操作系統(tǒng)的建立.pdf

1、傳染性胰腺壞死?。↖PN）是由傳染性胰腺壞死病毒（IPNV）引起的一種主要危害鮭鱒魚苗的高致死性疾病。自上世紀(jì)八十年代傳入中國(guó)至今仍沒有有效的防控藥物，而由于毒株存在變異及安全因素，國(guó)外商品化疫苗無(wú)法直接引進(jìn)及應(yīng)用。本課題組于2013年IPN暴發(fā)期間在中國(guó)云南省某虹鱒養(yǎng)殖場(chǎng)分離到一株IPNV強(qiáng)毒（命名為ChRtm213）。本文對(duì)該毒株的全基因組序列進(jìn)行了測(cè)定與分析，并在此基礎(chǔ)上利用反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建了重組IPNV病毒（rChRtm21

2、3）。本研究對(duì)全面了解IPNV的結(jié)構(gòu)與功能、揭示IPNV致病與免疫的分子機(jī)制等相關(guān)的研究具有重要意義。
　　本研究利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）方法，從IPNV-ChRtm213細(xì)胞培養(yǎng)物的總RNA中獲得了ChRtm213基因組片段并進(jìn)行了序列測(cè)定，與GenBank中IPNV序列進(jìn)行了比對(duì)，并運(yùn)用軟件對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。序列分析結(jié)果表明，ChRtm213毒株的全基因組序列包含一個(gè)A鏈（3099 bp）編碼多聚蛋白VP

3、2-VP4-VP3，和一個(gè)B鏈（2789 bp）編碼一個(gè)RNA依賴的RNA聚合酶VP1蛋白。系統(tǒng)發(fā)育分析表明， ChRtm213屬于基因1型，血清型為A9（Jasper），和日本IPNV毒株AM98具有最高的同源性，其中A鏈與B鏈相似性分別為96.3％和97.3%。
　　本研究通過(guò)In-Fusion無(wú)縫連接的方法成功構(gòu)建了以T7 RNA聚合酶介導(dǎo)的IPNV高效反向遺傳操作系統(tǒng)。分別在ChRtm213株A、B鏈上引入分子沉默性標(biāo)簽并

4、將其克隆在真核表達(dá)載體（ NDV vector）的T7啟動(dòng)子下游，構(gòu)建了ChRtm213-NDV-A和 ChRtm213-NDV-B重組質(zhì)粒，然后通過(guò)LipofectamineTM2000（Invitrogen）介導(dǎo)，與表達(dá)T7RNA聚合酶的真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染CHSE-214細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后96 h利用新的單層CHSE-214繼續(xù)擴(kuò)增。通過(guò)噬斑純化鑒定、電鏡觀察、間接免疫熒光檢測(cè)、酶切分子標(biāo)簽檢測(cè)證明了重組IPNV的存在。本研究成功構(gòu)建了I