雞傳染性法氏囊病病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的建立及基因功能研究.pdf

1、雞傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由雞傳染性法氏囊病病毒(InfectiousBursal Disease Virus,IBDV)引起的一種主要危害3-6周齡雛雞的急性、高度接觸性傳染病.該病于1957年首發(fā)于美國Gumboro地區(qū),50年來,一直威脅著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展.免疫抑制、抗原變異,特別是超強(qiáng)毒株(vvIBDV)的出現(xiàn),使得該病的防控形勢更加嚴(yán)峻.國際獸疫局(the OfficeInte

2、rnationnal des Epizooties,OIE) 將IBD列為"影響社會經(jīng)濟(jì)的重要疾病".關(guān)于IBDV的變異以及毒力和細(xì)胞嗜性的分子基礎(chǔ),一直是科研工作者研究的重點(diǎn)之一. 本課題組的前期研究將超強(qiáng)毒Gx株(vvIBDV)經(jīng)SPF雞胚傳5代、CEF上傳20代馴化致弱為減毒株Gt.Gx株致雞死亡率高達(dá)60﹪以上且不適應(yīng)CEF細(xì)胞培養(yǎng),Gt株對雞無明顯毒力且能在CEF上增殖,傳代致弱過程中的F9代毒對雞的毒力顯著降低而且適

3、應(yīng)CEF細(xì)胞培養(yǎng). 本研究建立了IBDV基因組長距離高保真PCR方法(LA-PCR),利用此方法克隆了IBDV減毒株Gt的全基因組以及超強(qiáng)毒Gx傳代致弱過程中的F9代毒的VP2并對其進(jìn)行了測序.序列分析發(fā)現(xiàn),與Gx株比較,F9代毒VP2有2個氨基酸突變(Q253H和A284T),Gt株VP2在此基礎(chǔ)上又有10個氨基酸突變.另外,Gx株與Gt株在VP3和VP4上各有4個、6個氨基酸差異.本研究的目的是構(gòu)建高效IBDV反向遺傳操作系

4、統(tǒng),研究VP2、VP3、VP4等基因的序列差異與IBDV細(xì)胞嗜性、復(fù)制和毒力的關(guān)系. 目前用于IBDV研究的體外轉(zhuǎn)錄、基于T7RNA聚合酶的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄、RNA聚合酶Ⅱ體內(nèi)轉(zhuǎn)錄等反向遺傳操作系統(tǒng)在病毒拯救效率和操作簡便性等方面仍然存在著一些問題.本研究以全新的思路成功構(gòu)建了RNA polymerase Ⅱ介導(dǎo)的IBDV高效反向遺傳操作系統(tǒng).分別在Gt株基因組兩端引入了錘頭狀核酶結(jié)構(gòu) (Hammerhead ribozyme,HamR

5、z) 和丁肝病毒核酶結(jié)構(gòu) (Hepatitis deltaribozyme.HdvRz),并將其克隆在真核表達(dá)載體pCAGGS的CMV增強(qiáng)子和β肌動蛋白啟動子下游,構(gòu)建IBDv感染性克隆pCAGGmGtAHRT和pCAGGmGtBHRT,經(jīng)Plasmid Midi Kit(QIAGEN)純化后,在Lipofectamine<'TM> 2000 (Invitrogen)的介導(dǎo)下,直接轉(zhuǎn)染DFI細(xì)胞,72h后取上清繼續(xù)在CEF上傳代.RT-

6、PCR、間接免疫熒光、電鏡等均檢測到了拯救的IBDV,且存在分子標(biāo)簽.拯救毒在CEF上能產(chǎn)生特有的砂礫狀CPE,且與親本毒Gt有一致的復(fù)制動力學(xué)曲線.該系統(tǒng)高效、簡便、穩(wěn)定,具有良好的細(xì)胞普適性,能在DFI、Vero/E6、Vero/P12等多種細(xì)胞上高效拯救出病毒.IBDV高效反向遺傳操作系統(tǒng)的建立為深入研究IBDV的基因功能奠定了基礎(chǔ),也為其它雙RNA病毒的反向遺傳操作提供借鑒. 采用融合PCR(fusion PCR)的方法

7、對Gx、F9、Gt等三個毒株的VP2基因進(jìn)行了相互替換,利用所建立的反向遺傳操作系統(tǒng),拯救出了三個VP2基岡嵌合病毒rGx-F9VP2、rGx-GtVP2、rGt-F9VP2.通過復(fù)制動力學(xué)試驗(yàn)和SPF雞攻毒試驗(yàn),證明:VP2的253和284位氨基酸決定IBDV細(xì)胞嗜性,Q253H和A284T可使vvIBDV適應(yīng)CEF培養(yǎng),并且具有明顯的減毒作用:VP2的 A222P、1242V、1256V、D279N、1294L、S299N、S330

8、R等七個氨基酸變化可促進(jìn)IBDV在CEF上的復(fù)制,這七個位點(diǎn)也與IBDV的毒力相關(guān). 另外,將vvIBDV Gx株的VP3/3'NCR、VP4/VP3/3'NCR、VP4替換Gt株的相應(yīng)區(qū)域,利用上述反向遺傳操作系統(tǒng),拯救出二個嵌合病毒rGt-GxVP3/3'NCR、rGt-GxVP4/VP3/3'NCR、rGt-GxVP4.通過病毒復(fù)制動力學(xué)試驗(yàn)和對SPF雞攻毒試驗(yàn),證明VP3與IBDV在CEF上的復(fù)制相關(guān)(其中P981L可能