雞傳染性法氏囊病病毒B細胞抗原表位研究.pdf

1、雞傳染性法氏囊病(InfectiousBursalDisease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的雞的一種高度接觸性傳染病。病毒在法氏囊的B淋巴細胞中迅速繁殖，損傷法氏囊的B淋巴細胞，引起嚴重的免疫抑制，從而導致疫苗免疫失敗和繼發(fā)感染的發(fā)生，對養(yǎng)雞業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。IBDV屬于雙RNA病毒科的成員，病毒基因組由A，B兩個片段的雙股RNA組成。其中，基因組B片段編碼病毒蛋白VP1，它是一種RNA依賴性的RNA聚合酶；基

2、因組A片段包含2個部分重疊的開放閱讀框架(ORF)，小ORF編碼分子量為17kDa的非結(jié)構(gòu)蛋白VP5；大ORF編碼一種分子量約110kDa的前體多聚蛋白，該蛋白在翻譯后進一步加工形成VP2、VP3和VP4，形成IBDV的結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒核衣殼的形成，攜帶病毒主要中和性B細胞抗原表位，誘導中和性抗體的產(chǎn)生。 B細胞抗原表位又稱抗原決定簇，是抗原分子上能夠被抗體分子識別的部位，在蛋白質(zhì)抗原中一般由幾個直接相鄰或構(gòu)象上相鄰的氨基酸組

3、成，決定著機體產(chǎn)生抗體的特異性，是誘導體液免疫的基本單位。對以體液免疫反應為主IBDV來說，鑒定其B細胞抗原表位便是揭示IBD體液免疫的本質(zhì)。 本項研究應用基因工程技術(shù)構(gòu)建了VP2和VP3基因原核表達載體pETVP2和pETVP3，并在大腸桿菌中誘導表達了雞IBDV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2和VP3。表達蛋白能夠與雞IBDV抗血清特異性反應，應用該表達蛋白鑒定出11株單克隆抗體識別VP2蛋白，2株單克隆抗體識別VP3蛋白。 然后

4、，在應用生物信息學原理分析雞IBDVVP2-4-3蛋白結(jié)構(gòu)特性的基礎(chǔ)上，合成了VP216-mer重疊多肽51條，VP212-mer重疊多肽64條，VP320-mer重疊多肽28條，VP312-mer重疊多肽30條，VP412-mer重疊多肽33條。合成多肽與載體蛋白BSA偶聯(lián)后，經(jīng)peptide-ELISA和Dot-ELISA檢測其與雞IBDV單克隆抗體或多抗的反應性。結(jié)果顯示，VP2中含有5個中和性單克隆抗體識別的線性表位：EP1：3

5、7TLRSETSTYNLTV49；EP2：76SNGNYKF82；EP3：201DRPRVYTITAADDYQFS217；EP4：326SWSARGSLAVTI337；EP5：403SERDRLGIKTVW414和6個多抗反應位點：ES1：91NLPASYNYCRLVSRSLTV108；ES2：331GSLAVTIHGGNYPGALRPVTLV352；ES3：371FELIPNPELAKNLVTEYG388；ES4：433NSPLKIA

6、GAFGFK445；ES5：449RAIRRIAVPVVS460；ES6：495ASGKARAASGRIRQLTLA512。VP3中含有2個中和性單克隆抗體識別線性表位：728PRDWDRLPYLNL739；982PKPKPKPNAPTQ993和4個多抗反應位點：ES7：818LANAPQAGSKSQRA831，ES8：851QREKDTRISKKMETMGIYFATP872，ES9：876ALNGHRGPSPGQLKYWQNTREI8

7、97，ES10：961QMKDLLLTAMEMK973。VP4中含有2個多抗識別位點：ES11：531VVDGILASPGVLRGAHNLDCVLREGATL558，ES12：593PSQRGSFIRTLSGHRVYGYAPDGV616。VP2和VP3單克隆抗體識別的抗原表位多肽同時也能夠與雞IBDV多抗血清反應。 應用噬菌體展示的隨機7肽庫對雞IBDVVP2蛋白中和性單克隆抗體YNW17和YNW29進行生物淘選，單克隆抗體YN

8、W17和YNW29識別噬菌體展示外源多肽的基序分別為D-X-P-R和A-R-G。序列比對分析這兩株單克隆抗體識別的多肽基序分別位于VP2氨基酸201-204和329-331。通過重疊多肽合成技術(shù)和單克隆抗體抑制實驗證明單克隆抗體YNW17識別VP2表位的氨基酸序列為：197CDSSDRPRVYTIT209單克隆抗體YNW29識別表位的序列為：329ARGSLAVTI337。進一步精確定位了表位EP3和EP4的序列范圍。應用單克隆抗體YN