對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒（中國福建株）的基因組克隆及其重組衣殼蛋白自組裝成病毒樣顆粒的初步研究.pdf

1、對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(infectious hypodemal andhematopoietic necrosis virus， IHHNV)是世界各地養(yǎng)殖和野生對(duì)蝦的重要病原之一，是已知的最小的對(duì)蝦病毒，隸屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)短濃核癥病毒屬(Brevidensovirus)。它分布廣泛，雖然對(duì)對(duì)蝦的致死率已經(jīng)不是很高，但能使已被廣泛養(yǎng)殖的凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)生長畸形，

2、導(dǎo)致慢性矮小殘缺綜合癥(runt-deformity syndrome，RDS)，造成較大經(jīng)濟(jì)損失。目前，GenBank已收錄了分離自夏威夷、加利福尼亞、泰國、中國臺(tái)灣等地的IHHNV全長或部分基因組序列。雖然中國大陸在養(yǎng)殖對(duì)蝦中也普遍檢測到了IHHNV，但未見其基因組序列報(bào)道。本論文首先利用DNA末端加尾和嵌套PCR克隆了IHHNV基因組兩末端序列，并根據(jù)測定的末端序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增出中國福建株IHHNV基因組序列。福建株IHH

3、NV基因組長3833nt，與夏威夷和加利福尼亞分離株相似性較高，差異主要集中于DNA的5’末端，且三者存在5’末端單核苷酸的差異。IHHNV基因組由兩末端非編碼序列和三個(gè)開放閱讀框(open reading frame，ORF)構(gòu)成。三個(gè)ORF分別包含2001nt、 1092nt和990nt，預(yù)測分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白1(nonstructural protein 1，NS1)，非結(jié)構(gòu)蛋白2(nonstructural protein 2，

4、NS2)和衣殼蛋白(capsid protein，CP)。本論文將全長衣殼蛋白基因克隆到pET-his表達(dá)載體，在Escherichia coli BL21中重組表達(dá)了在氨基末端融合有六個(gè)組氨酸標(biāo)簽的衣殼蛋白。重組 IHHNV 衣殼蛋白(recombinant IHHNV capsid protein，rICP)既以可溶形式也以包涵體形式表達(dá)，所以分別在天然條件和變性條件下用Ni柱親和層析方法對(duì)不同表達(dá)形式的rICP進(jìn)行純化。電鏡結(jié)果顯

5、示，可溶性的rICP可形成直徑約20nm的均一的病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)，其外觀與已報(bào)道過的天然IHHNV病毒顆粒非常相似。另外，溶解于8 M尿素中的變性蛋白經(jīng)純化和透析復(fù)性去除變性劑后未能自組裝成完全或不完全的病毒樣顆粒?？梢钥闯觯琁HHNV VLPs的形成不需要IHHNV的其他蛋白及其DNA或RNA的參與，并且融合表達(dá)的His標(biāo)簽展示于VLPs的表面且不影響VLPs的形成，能夠與Ni-NTA樹

6、脂結(jié)合使VLPs得以富集。細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)VLPs能吸附并進(jìn)入凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞。鑒于IHHNV與白斑桿狀病毒(white spot syndromevirus，WSSV)有著相似的宿主范圍且兩者能同時(shí)感染多種對(duì)蝦，有報(bào)道稱預(yù)先感染ⅢHNV的凡納濱對(duì)蝦在感染W(wǎng)SSV后能延緩死亡，期望將IHHNV VLPs改造成能攜帶抗病毒藥物或者抗WSSV物質(zhì)(如siRNA)的載體，并進(jìn)入已感染W(wǎng)SSV的對(duì)蝦細(xì)胞，發(fā)揮干擾WSSV感染或者阻斷WSSV基