傳染性肌肉壞死病毒多肽1和凡納濱對(duì)蝦半乳糖凝集素及Akirin的功能研究.pdf

1、對(duì)蝦是我國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，但是病原微生物導(dǎo)致的疾病給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。因此，研究病原與對(duì)蝦的互作機(jī)制以及對(duì)蝦的抗病免疫機(jī)理對(duì)防御疾病以及促進(jìn)對(duì)蝦抗病育種工作具有重要的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用意義。本研究以傳染性肌肉壞死病毒（Infectious myonecrosis virus，IMNV）編碼的多肽1以及凡納濱對(duì)蝦的半乳糖凝集素和Akirin為對(duì)象，分別研究了三者在病毒感染以及對(duì)蝦抗菌免疫中的作用。
　　傳染性肌肉壞死病是由傳

2、染性肌肉壞死病毒引起的，主要感染對(duì)象是凡納濱對(duì)蝦?；疾?duì)蝦出現(xiàn)肌肉壞死、白濁并且在對(duì)蝦養(yǎng)成期會(huì)達(dá)到70％的累計(jì)死亡率。前期研究預(yù)測(cè)到IMNV基因組的開(kāi)放閱讀框1編碼的多肽1(Peptide1，P1)是一種雙鏈RNA(dsRNA)結(jié)合蛋白(dsRNA binding domain，dsRBD)，但是P1在IMNV感染對(duì)蝦中的功能并不清楚。本研究通過(guò)P1及其突變體的原核表達(dá)、凝膠遷移阻滯試驗(yàn)、快速蛋白液相色譜、多角度光散射分析、RNA干擾報(bào)

3、告試驗(yàn)、下拉試驗(yàn)等證明P1能通過(guò)結(jié)合dsRNA和小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)抑制宿主抗病毒的RNA干擾通路，很可能是IMNV破壞對(duì)蝦抗病毒免疫RNA干擾的一種途徑。半乳糖凝集素是一種重要的模式識(shí)別受體而Akirin是NF-κB通路下游的核轉(zhuǎn)錄輔助因子，因此本文還利用基因克隆、原核表達(dá)、RNA干擾、細(xì)菌的結(jié)合和吞噬試驗(yàn)等研究了凡納濱對(duì)蝦的半乳糖凝集素和Akirin在對(duì)蝦抗細(xì)菌免疫中的功能。本文主要

4、內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.P1通過(guò)其C端“αβββα”型的dsRBD結(jié)合dsRNA
　　由于起始密碼子的不確定性，P1可能存在長(zhǎng)短不同的兩種蛋白，分別是LP1(LongP1，1-196 aa)和SP1(Short P1，56-196aa)。本研究通過(guò)對(duì)LP1的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其N端有一個(gè)蛋白結(jié)合域，C端有一個(gè)“αβββα”型dsRNA結(jié)合域。為了驗(yàn)證P1是否有結(jié)合dsRNA的活性，本研究首先利用原核表達(dá)的LP1和SP1蛋

5、白與90 bp的dsRNA進(jìn)行凝膠遷移阻滯試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)LP1和SP1均能結(jié)合dsRNA但是在膠孔處形成了大的復(fù)合體?？紤]到P1的N端預(yù)測(cè)到一個(gè)蛋白結(jié)合域，LP1和SP1可能通過(guò)其N端的蛋白結(jié)合域形成了同源多聚體，當(dāng)這一多聚體結(jié)合dsRNA后會(huì)形成更大的復(fù)合體。于是本研究?jī)H利用不含蛋白結(jié)合域的P1的C端(SSP1，super short P1)進(jìn)行凝膠遷移阻滯試驗(yàn)證明SSP1結(jié)合dsRNA后遷移良好，不再停滯在膠孔。SSP1突變體的凝膠遷移

6、阻滯試驗(yàn)進(jìn)一步證明了參與P1結(jié)合dsRNA的保守氨基酸(H128、K151、K154)。SSP1的梯度凝膠遷移阻滯試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1分子SSP1能夠結(jié)合8-9 bp的dsRNA，這符合經(jīng)典的“αβββα”型dsRBD結(jié)合dsRNA的特征。
　　2.LP1或SP1通過(guò)其N端的蛋白結(jié)合域形成了同源多聚體
　　P1的凝膠遷移阻滯試驗(yàn)間接表明LP1或者SP1可能通過(guò)N端形成了同源多聚體。本研究進(jìn)一步對(duì)LP1的N端序列分析，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)可能的

7、蛋白互作基序（64-ILKLL-68和79-ILHLL-83）。為了驗(yàn)證P1是否形成了自身多聚體以及預(yù)測(cè)的蛋白互作基序是否參與了多聚體的形成，本研究利用原核表達(dá)的LP1、SP1、SSP1及LP1在蛋白互作基序處的突變體進(jìn)行的化學(xué)交聯(lián)試驗(yàn)初步表明LP1及SP1通過(guò)N端的蛋白結(jié)合域形成了同源多聚體，并且其N端的蛋白基序64-ILKLL-68和79-ILHLL-83參與了多聚體的形成。P1及其突變體的快速蛋白液相色譜進(jìn)一步證明了這一結(jié)果。SP

8、1的多角度光散射分析證明其至少以自身二聚體的形式存在。
　　3.P1通過(guò)結(jié)合dsRNA和siRNA抑制宿主抗病毒的RNA干擾免疫
　　RNA干擾是真核生物抵抗病毒感染的一種重要的免疫途徑，而某些病毒會(huì)編碼蛋白抑制宿主的RNA干擾達(dá)到保護(hù)自身的目的。本研究利用以雙熒光素酶為基礎(chǔ)的RNA干擾(RNAi)報(bào)告試驗(yàn)證明P1的C端和N端能夠獨(dú)立地抑制dsRNA介導(dǎo)的RNAi。P1在dsRNA結(jié)合域的突變體的RNAi報(bào)告試驗(yàn)進(jìn)一步表明P

9、1的C端抑制RNAi是因?yàn)槠淠芨?jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合dsRNA，從而阻止dsRNA被宿主的核糖核酸內(nèi)切酶Dicer-2切割。除此之外，LP1和SSP1能夠抑制siRNA介導(dǎo)的RNAi。凝膠遷移阻滯試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SSP1結(jié)合21nt siRNA，從而阻止siRNA裝配到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體發(fā)揮作用?？傊?，P1能夠在dsRNA和siRNA水平上抑制宿主的RNA干擾免疫。
　　4.P1定位于果蠅S2細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核
　　亞細(xì)胞定位試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LP

10、1分布在果蠅S2細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。病毒蛋白的類泛素化是其進(jìn)入細(xì)胞核的一種途徑。通過(guò)對(duì)LP1的序列進(jìn)行類泛素化預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其含有可能的類泛素化基序，但是利用不含類泛素化基序的SSP1進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)SSP1同樣可以進(jìn)入細(xì)胞核。而且體外的下拉試驗(yàn)以及免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)LP1并沒(méi)有結(jié)合到參與類泛素化反應(yīng)的凡納濱對(duì)蝦的UBC9蛋白和成熟體的類泛素分子。因此，P1的入核機(jī)制及是否被類泛素化還需要深入研究。
　　5.凡納濱對(duì)蝦半乳糖凝集素基因的

11、克隆及免疫功能研究
　　本研究首次在凡納濱對(duì)蝦中克隆到了一種半乳糖凝集素（Litopenaeus vannameigalectin，LvGal）基因，預(yù)測(cè)其編碼蛋白有338個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其N端含有一個(gè)保守的糖類結(jié)合域。LvGal的序列分析發(fā)現(xiàn)其含有典型的糖結(jié)合的基序H-NPR與WG-ER的部分氨基酸。熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LvGal組成性表達(dá)在所檢測(cè)各個(gè)組織中，在血細(xì)胞和鰓中的表達(dá)量較高。LvGal的mRNA在鰻弧菌刺激后

12、的6和12小時(shí)表達(dá)上調(diào)，這預(yù)示著其可能參與對(duì)蝦對(duì)細(xì)菌感染的免疫應(yīng)答。本研究接著利用原核表達(dá)的LvGal進(jìn)行體外的細(xì)菌結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LvGal能夠結(jié)合鰻弧菌和溶壁微球菌。細(xì)菌凝集試驗(yàn)表明LvGal能夠以金屬離子非依賴性的方式凝集鰻弧菌，但是并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)LvGal對(duì)鰻弧菌和溶壁微球菌具有抑菌活性。最后的體內(nèi)試驗(yàn)表明LvGal促進(jìn)了對(duì)蝦血細(xì)胞對(duì)鰻弧菌的吞噬。因此，LvGal很可能是通過(guò)結(jié)合、凝集細(xì)菌并促進(jìn)血細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬而發(fā)揮作用的。
　

13、　6.凡納濱對(duì)蝦Akirin基因的克隆及免疫功能的初步研究
　　Akirin是一種高度保守的核蛋白，其在果蠅中的免疫功能被認(rèn)為是促進(jìn)NF-κB依賴的抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄。本研究在凡納濱對(duì)蝦中克隆到了Akirin（LvAkirin）并對(duì)其免疫功能進(jìn)行了初步研究。經(jīng)過(guò)預(yù)測(cè)分析，LvAkirin有212個(gè)氨基酸，并且有兩處典型的核定位信號(hào)分別是N端的24-30: PHKRRC和78-81: KRRK。多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明LvAkiri

14、n與日本對(duì)蝦的Akirin親緣關(guān)系較近。LvAkirin組成性表達(dá)在所檢測(cè)的組織中，在精巢中表達(dá)量最高，其次是血細(xì)胞，這預(yù)示著LvAkirin可能會(huì)像其他動(dòng)物的Akirin一樣，在對(duì)蝦發(fā)育和免疫應(yīng)答中起作用。LvAkirin的mRNA在副溶血弧菌刺激后的2，6和24小時(shí)被檢測(cè)到表達(dá)上調(diào)。利用RNAi技術(shù)特異性沉默LvAkirin后檢測(cè)相關(guān)抗菌肽基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AA-K型抗脂多糖因子、P型甲殼素和對(duì)蝦素3a的表達(dá)出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)。這表