原核表達(dá)手掌參GcGASA蛋白的光譜學(xué)及功能研究.pdf

1、赤霉酸誘導(dǎo)的富含半胱氨酸蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)的一類在N-末端具有一段不同長度的信號肽，C-末端含有12個保守的半胱氨酸殘基的蛋白，這類蛋白在多種植物的重要生理過程中發(fā)揮著重要作用。本研究旨在利用原核表達(dá)獲取可溶性的手掌參中赤霉酸誘導(dǎo)的富含半胱氨酸蛋白（GcGASA），研究其體外活性并運(yùn)用熒光光譜學(xué)手段研究其內(nèi)源熒光。
　　方法：利用pET-32(a)作為原核表達(dá)載體，對手掌參中赤霉酸誘導(dǎo)的富含半胱氨酸蛋白GcGASA進(jìn)行原核表達(dá)。并通

2、過親和層析、SDS-PAGE、Native-PAGE等對原核表達(dá)融合蛋白Trx-GcGASA進(jìn)行純化和鑒定。利用瓊脂糖擴(kuò)散法抑菌試驗(yàn)和清除過氧化氫實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 Trx-GcGASA的體外活性，并利用穩(wěn)態(tài)熒光光譜檢測對經(jīng)過DTT還原，Native形態(tài)，氧化劑處理，以及鹽酸胍變性的融合蛋白Trx-GcGASA進(jìn)行熒光光譜學(xué)研究。
　　結(jié)果：Native-PAGE檢測結(jié)果顯示經(jīng)原核表達(dá)和純化得到的融合蛋白以單體和三聚體兩種形式存在。融合蛋白

3、的抗微生物活性和抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果顯示，融合蛋白在10uM濃度時能夠使大腸桿菌出現(xiàn)明顯聚集，然而沒有明顯的清除H2O2能力。穩(wěn)態(tài)熒光光譜學(xué)研究顯示：(1)當(dāng)激發(fā)波長在250nm-280nm之間時，原核表達(dá)純化得到的融合蛋白Trx-GcGASA的熒光發(fā)射主要源于酪氨酸殘基。(2)DTT還原處理之后，融合蛋白色氨酸的熒光強(qiáng)度顯著增加。(3)融合蛋白經(jīng)過氧化型的谷胱甘肽 GSSG或者過氧化氫氧化處理之后，其中酪氨酸和色氨酸的熒光強(qiáng)度都有所降低

4、，而這與文獻(xiàn)報(bào)道的此類蛋白的抗氧化活性一致。(4)無論經(jīng)過1 mM DTT還原處理與否，融合蛋白在6M鹽酸胍存在的條件下都不能徹底變性，色氨酸的最大熒光發(fā)射峰位置小于350nm。(5)變性曲線顯示，原核表達(dá)純化得到的融合蛋白Trx-GcGASA在346.2nm處的熒光強(qiáng)度在鹽酸胍濃度為2M-3M之間時發(fā)生突變，應(yīng)用蛋白變性兩態(tài)模型計(jì)算得到融合蛋白的Gibbs自由能為3.7 kJ.mol-1。然而，經(jīng)過1 mM DTT還原的融合蛋白卻表現(xiàn)