手掌參GcGASA蛋白和突變體的表達(dá)、純化、氧化重折疊和抗菌抗氧化活性的研究.pdf

1、赤霉酸誘導(dǎo)的富含半胱氨酸蛋白在植物根生長(zhǎng)、莖延伸，果實(shí)成熟等生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。雖然目前關(guān)于該類蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)未見報(bào)道，但是通過氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該家族蛋白的C-末端含有12個(gè)保守的半胱氨酸殘基，分布情況是CX3CX3CX8CX3CX2CCX2CXCX11CPCX12C，其中CXXC結(jié)構(gòu)域通常具有氧化還原活性。因此，本研究旨在利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲取一種新型藏藥材手掌參中赤霉酸誘導(dǎo)的富含半胱氨酸蛋白的野生型（GcGASA）和突

2、變體，并研究其在體內(nèi)、體外抗氧化活性和抗真菌活性。
　　方法：采用pET-28a(+)作為原核表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并以此為模板通過PCR定點(diǎn)突變獲得突變體SS-GcGASA，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，及包涵體的變性復(fù)性獲得可溶性目標(biāo)蛋白，并分別通過凝膠過濾和SDS-PAGE對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化和鑒定；采用檢測(cè)蛋白體外清除DPPH自由基和過氧化氫的方法來研究蛋白體外抗氧化活性，并通過檢測(cè)宿主菌抗過氧化氫損傷的方法來檢測(cè)蛋白體內(nèi)抗氧化活性

3、。此外，采用瓊脂糖擴(kuò)散分析法檢測(cè)融合蛋白及其突變體抗禾谷鐮刀菌的活性。
　　結(jié)果：測(cè)序結(jié)果表明：目標(biāo)基因gcgasa成功插入表達(dá)載體pET-28a(+)，并引入兩個(gè)Ser突變位點(diǎn)；SDS-PAGE顯示IPTG誘導(dǎo)后的融合蛋白多以包涵體形式存在，通過對(duì)包涵體變性復(fù)性和凝膠過濾純化的方法獲得較高純度濃度的野生型和突變型目標(biāo)蛋白；融合蛋白的體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示野生型蛋白在0.3 mg/mL濃度時(shí)具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力，

4、在有DTT還原劑存在的情況下，野生型蛋白在0.3 mg/mL的濃度時(shí)具有明顯清除過氧化氫的活性，且其活性與濃度正相關(guān)，但在此濃度下突變型蛋白卻沒有抗氧化活性；野生型蛋白的體內(nèi)抗氧化活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與pET28a空載相比，過氧化氫對(duì)表達(dá)表達(dá)目標(biāo)蛋白的宿主菌的損傷程度明顯要弱，尤其是加入高濃度的過氧化氫后，這種現(xiàn)象更明顯；融合蛋白的體外抗真菌活性檢測(cè)結(jié)果顯示，目標(biāo)蛋白和突變體濃度為0.3 mg/mL時(shí)，對(duì)禾谷鐮刀菌有明顯的抑菌活性，而且