HBV X蛋白在不同啟動子調(diào)控表達時對細胞凋亡影響的差異.pdf

1、全球乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染者已超過3.5億人，我國是HBV感染的高發(fā)區(qū)。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，資料顯示HBV慢性感染是肝細胞癌發(fā)生的主要危險因素，但HBV致癌的具體機制尚不很清楚。
　　 HBV X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)是乙型肝炎病毒(HBV)X基因區(qū)編碼的多肽，參

2、與調(diào)控細胞凋亡。HBx對細胞凋亡的影響在不同的報道中差別很大，這種區(qū)別很有可能是因為實驗條件及所應用的細胞類型的不同所引起，Clippinger等通過體外培養(yǎng)鼠原代細胞來觀察HBx對細胞凋亡的影響，他們發(fā)現(xiàn)HBx可以通過刺激NF-kb(nuclear transcription factor，核轉(zhuǎn)錄因子)而抑制凋亡通路的活化，盡管如此，當NF-kb通路阻斷時，HBx可以促進凋亡，進一步阻斷線粒體通透性可以抑制HBx誘導的細胞凋亡，此實驗

3、可能提示HBx可以促進細胞凋亡也可以抑制細胞凋亡，主要取決于NF-kb的活化狀態(tài)。目前文獻報道的HBx的作用存在一個共同點：即HBx大多是在其過表達的狀態(tài)下來觀察其作用的，這種過表達一般是在強啟動子啟動下的表達，如對于HBx重組體的構(gòu)建應用較多的是真核表達載體peDNA3、pcDNA3.1、pEGFPC1、pBind等，而這些表達載體大多是在巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動子的啟動下表達目的基因。然而，在自然條件

4、下感染HBV時，HBx的表達是受HBV X基因啟動子及HBV上的增強子調(diào)控的，其表達量與HBV的復制亦存在一定關(guān)系，因而HBx蛋白自然表達時的確切作用有待進一步研究。
　　 細胞凋亡是一種多基因參與的、復雜的過程，是細胞主動參與的“自殺”機制。這是機體正常發(fā)育和新陳代謝的必要過程，受到體內(nèi)正負反饋機制調(diào)控，是機體抗病毒防御和病毒生存之間斗爭的結(jié)果。因參與凋亡調(diào)節(jié)的基因，在體內(nèi)不同環(huán)境所起作用不同，使病毒參與的細胞凋亡調(diào)控愈顯復雜

5、。深入研究HBV X基因與肝細胞凋亡的關(guān)系，對揭示病毒致病致癌機制，探求HBV預防治療的新手段具有重要意義。
　　 研究目的：
　　 通過構(gòu)建不同啟動子調(diào)控HBV X基因表達的重組質(zhì)粒，觀察HBV X基因表達量的差別，并進一步研究不同表達量的HBx對肝癌細胞凋亡調(diào)控作用的差異，進而為闡明HBx導致肝癌發(fā)生的機制提供理論依據(jù)。
　　 實驗方法：
　　 將CMV啟動子與HBV X基因及其后的polyA(pol

6、yadenylic acid，多聚腺苷酸加尾序列)連接插入pGEM-7zf(+)載體構(gòu)建pCMVX重組質(zhì)粒，以含1.2倍HBV全基因組的payw1.2及相應X基因第八位密碼子終止突變后的payw*7為模版利用PCR法擴增HBV EnhⅠ、X基因啟動子、X基因及polyA尾并插入pGEM-7zf(+)載體構(gòu)建pEPX1.2及pEPX*7重組質(zhì)粒，利用雙酶切的方法從payw1.2中切下含X基因啟動子、X基因及polyA尾片段并插入pGEM-

7、7zf(+)載體構(gòu)建pPX重組質(zhì)粒。經(jīng)菌落PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈式反應)及測序鑒定確認構(gòu)建成功后使用FugeneHD將上述四種重組質(zhì)粒及對照載體pGEM-7zf(+)瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細胞，RT-PCR及Western blot鑒定HBV X基因的轉(zhuǎn)錄與表達及各組之間表達量的差異，轉(zhuǎn)染后連續(xù)6天用MTT法檢測各組轉(zhuǎn)染細胞的活性，轉(zhuǎn)染后48小時流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，共檢測5次，所有數(shù)據(jù)

8、均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，以配對t檢驗進行分析，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結(jié)果：
　　 經(jīng)菌落PCR及測序鑒定成功構(gòu)建了不同啟動子調(diào)控HBV X基因表達的重組質(zhì)粒pCMVX、pEPX1.2、pEPX*7、pPX，RT-PCR檢測顯示在轉(zhuǎn)染后的細胞HepG2/pCMVX、HepG2/pEPX1.2、HepG2/pEPX*7、HepG2/pPX均有HBV X基因的轉(zhuǎn)錄，其表達量的關(guān)系為H

9、epG2/pCMVX＞HepG2/pEPX1.2、HepG2/pEPX*7＞HepG2/pPX(p＜0.05)。Western blot檢測各組轉(zhuǎn)染細胞僅有HepG2/pCMVX細胞有HBx蛋白的表達。MTT法顯示在轉(zhuǎn)染后第六天六種細胞的OD490依次是0.737±0.012、0.952±0.020、1.299±0.099、1.185±0.124、1.310±0.097、1.412±0.123，HepG2/pCMVX、HepG2/pEP

10、X1.2、HepG2/pPX與HepG2/pGEM-7zf(+)相比有明顯差異(p＜0.05)，其中，HepG2/pCMVX＜HepG2/pEPX1.2＜HepG2/pPX(p＜0.05)。而HepG2/pEPX*7與HepG2/pGEM-7zf(+)的細胞活性無明顯差異(p＞0.05)。流式細胞儀顯示HepG2/pCMVX、HepG2/pEPX1.2、HepG2/pEPX*7、HepG2/pPX、HepG2/pGEM-7zf(+)、H

11、epG2在轉(zhuǎn)染48小時后凋亡率分別為：23.440％±0.017％、10.260％±0.009％、5.120％±0.567％、7.220％±0.716％、5.020％±0.409％、4.520％±0.377％。HepG2/pCMVX、HepG2/pEPX1.2、HepG2/pPX明顯高于HepG2/pGEM-7zf(+)(p＜0.05)，且三者之間的凋亡率HepG2/pCMVX＞HepG2/pEPX1.2＞HepG2/pPX(p＜0.0

12、5)；HepG2/pEPX*7與HepG2/pGEM-7zf(+)比較無明顯差異(p＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.不同啟動子調(diào)控HBV X基因表達的重組質(zhì)粒pCMVX、pEPX1.2、pEPX*7、pPX轉(zhuǎn)染細胞時X基因表達量有明顯差異，其中HepG2/pCMVX表達量最大。
　　 2.本研究再次證實了HBx能促進細胞凋亡。
　　 3.本研究結(jié)果表明當HBx由不同啟動子調(diào)控表達時，其促細胞凋亡的