KDR特異性啟動(dòng)子-增強(qiáng)子調(diào)控PI3K信號(hào)通路對(duì)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的：4管內(nèi)皮細(xì)胞(vascularendothelialcells，VEC)是血管的主要結(jié)構(gòu)之一，VEC損傷導(dǎo)致的早期血栓形成是冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后移植血管狹窄的啟動(dòng)因素，促進(jìn)VEC的修復(fù)再生可有效防治移植血管狹窄。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)大鼠VECPI3Kp110β亞單位編碼基因Pik3cb，利用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建KDR特異性啟動(dòng)子/增強(qiáng)子真核表達(dá)載體，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染大鼠VEC，探討其對(duì)大鼠VEC增殖和凋亡的影響，進(jìn)一步探索移植血管狹窄的防治方

2、法。
　　 方法：根據(jù)Genbank中PI3Kp110β亞單位編碼基因Pik3cbmRNA序列，按照shRNA設(shè)計(jì)原則，分別構(gòu)建大鼠VEC特異性KDR真核表達(dá)載體KDR-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA和非特異性CMV真核表達(dá)載體CMV-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA。經(jīng)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑LipofectaminTM2000轉(zhuǎn)染大鼠VEC，實(shí)驗(yàn)分為5組，A組：正常VEC組；B組：轉(zhuǎn)染特異性質(zhì)粒KDR-

3、pGenesil-10-Pik3cb-shRNA組；C組：轉(zhuǎn)染非特異性質(zhì)粒CMV-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA組；D組：轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照空質(zhì)粒組；E組：陽(yáng)性對(duì)照組(wortmannin)。分別于轉(zhuǎn)染24h、48h和72h，流式細(xì)胞法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞Pik3cbmRNA的相對(duì)表達(dá)量，CCK-8法和流式細(xì)胞法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖和凋亡水平。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染24h、48h和72h，轉(zhuǎn)染效率

4、分別為（35.2±4.6）％，（25.7±1.8）％和(16.7±1.6)％；實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)得KDR組Pik3cbmRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(54.82±2.77)％，（50.54±3.98）％和（35.47±4.83）％，均明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.05)；CCK-8法測(cè)得KDR組細(xì)胞抑制率分別為（21.98±2.25）％，（24.32±3.04）％和（26.38±5.06）％；流式細(xì)胞法測(cè)得KDR組細(xì)胞凋亡率分別為（9.8