SM22α和KDR啟動子-增強子基因調控PI3K信號通路對移植血管新生內膜增生的影響.pdf

1、目的：采用組織特異性啟動子SM22α和KDR，結合RNA干擾原理，構建靶向大鼠Pik3cb基因的真核表達載體，通過Pluronic F-127緩釋系統(tǒng)轉染大鼠頸靜脈移植血管，研究其對VSMC、VEC及靜脈移植血管新生內膜增生的影響，探索有效防治靜脈移植血管狹窄的新方法，并為預防血栓形成提供理論依據。
　　 方法：根據Genbank數據庫提供的大鼠PI3K p110β亞單位編碼基因Pik3cb mRNA序列 (NM：053481)

2、，按照shRNA設計原則，分別構建合成含有SM22αp/e、KDR p/e和CMV pGenesil-1的質粒表達載體，并命名為SM22α-Pik3cb-shRNA、KDR-Pik3cb-shRNA和CMV-Pik3cb-shRNA。建立大鼠頸靜脈-動脈移植模型，通過Pluronic F-127質粒緩釋系統(tǒng)在血管吻合完成后進行局部RNA干擾。實驗分6組，每組30只SD大鼠。A組：對照組（25％ Pluronic F-127組）；B組：K

3、DR-Pik3cb-shRNA組；C組：SM22α-Pik3cb-shRNA組；D組：CMV-Pik3cb-shRNA組；E組：KDR-Pik3cb-shRNA+SM22α-Pik3cb-shRNA混合組；F組：陽性對照組（wortmannin組）。根據實驗分組的不同，將含有50μg shRNA質粒，或50μg wortmannin的凝膠，或單純200μL 25％ Pluronic F-127凝膠均勻涂抹在移植靜脈周圍，分別于術后1d、

4、3 d、7 d、14 d和28 d截取移植血管。HE染色觀察新生內膜厚度；免疫組化檢測磷酸化mTOR（Ser2448）；TUNEL法測細胞凋亡。另設一組，于術后3 d取材，熒光定量PCR測定Pik3cb mRNA的相對表達量。
　　 結果：成功構建大鼠頸靜脈分支-頸動脈間置模型，大體觀察移植血管通暢率， KDR-Pik3cb-shRNA組通暢率最低（23.3％），與對照組相比有統(tǒng)計學意義（x2=4.593，P＜0.05）；SM2

5、2α-Pik3cb-shRNA組通暢率最高（86.7％），與對照組相比有統(tǒng)計學意義（x2=9.32，P＜0.01）。
　　 術后3 d，熒光定量PCR檢測Pik3cb mRNA相對表達量，陽性對照組和質粒轉染組較對照組明顯下降，有統(tǒng)計學意義（F=386.3，P＜0.01）。B組、C組、D組、E組和F組較對照組分別下降了46.8％、73.3％、81.2％、64.2％和68.4％。
　　 術后1～3 d各組新生內膜厚度差別無

6、統(tǒng)計學意義；術后7 d各組新生內膜比較有統(tǒng)計學意義（F=82.59，P＜0.01），術后14 d各組新生內膜比較有統(tǒng)計學意義（F=325.09，P＜0.01），術后28 d各組新生內膜比較有統(tǒng)計學意義（F=483.76，P＜0.01）；術后28 d時，對照組新生內膜較術后1d增厚10.4倍；B組、C組、D組、E組和F組分別增厚11.6倍、6.0倍、7.1倍、6.8倍和6.5倍。
　　 陽性對照組和質粒轉染組移植靜脈磷酸化mTOR

7、（Ser2448）表達陽性面積均明顯低于正常對照組，有統(tǒng)計學意義（F=50.41，P＜0.05）；28 d時，B組、C組、D組、E組和F組陽性面積百分比分別為0.93％、0.69％、0.49％、0.47％和0.43％，而對照組陽性百分比為1.48％。
　　 各組術后不同時間點移植靜脈組織凋亡細胞陽性面積均明顯高于正常對照組，有統(tǒng)計學意義(F=134.38，P＜0.05)；14 d時各組凋亡細胞陽性面積達高峰，對照組1.27％，B

8、組、C組、D組、E組和F組分別為1.95％、2.43％、3.18％、3.06％和2.94％。
　　 結論：大鼠頸靜脈分支-頸動脈間置模型是一種研究血管旁路移植術后橋血管狹窄的理想模型；SM22α-Pik3cb-shRNA可抑制血管新生內膜增生，其作機制可能是下調血管平滑肌細胞PI3K-Akt-mTOR信號通路而抑制血管平滑肌細胞增值并促進其凋亡；KDR-Pik3cb-shRNA可導致移植血管血栓形成，增加移植血管新生內膜厚度，其