TNF-α通過α7nACHR調節(jié)內皮祖細胞功能.pdf

1、血管內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，是一種能直接分化為血管內皮細胞的前體細胞，不儀參與人胚胎血管生成，而且也參與出生后的血管新生及血管內皮損傷后的修復過程。在炎癥反應中，內皮細胞不僅是參與者，還是首先受損的靶細胞，進而造成微血管損傷、微循環(huán)障礙，這可能是器官功能障礙的始發(fā)環(huán)節(jié)。大量的動物和臨床試驗已經證明：創(chuàng)傷時，循環(huán)及組織中的EPCs動員、增殖，并分化為內皮細胞修復損傷的血管內皮細胞，

2、從而改善微循環(huán)，增加器官供血；而如果創(chuàng)傷嚴重，發(fā)生EPCs的調節(jié)失代償，則會導致微循環(huán)的損傷無法修復，進一步加重器官損害，直至功能衰竭，發(fā)生MODS。
　　 近年來，臨床上通過內皮祖細胞移植治療心腦血管疾病、腫瘤血管形成及創(chuàng)傷等缺血性疾病取得了重要成功，顯示了廣闊的應用前景。但是從在臨床應用上也存在一定的限制：一是培養(yǎng)數量有限，不能滿足臨床治療需要；二是培養(yǎng)時間較長，容易導致延誤最佳的治療時間。
　　 煙堿樣乙酰膽堿受體

3、(nicotinic acetylcholine receptors，nAChR)α-7亞型屬于配體門控型離子通道受體，是迷走神經激活的“膽堿能抗炎通路”的一個重要成分，機體能通過膽堿能抗炎通路調節(jié)炎癥過程中腫瘤壞死因子(TNF)、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)和其他細胞因子的水平。研究發(fā)現，在血管內皮祖細胞表面表達α7nACHR，且對EPCs的功能調節(jié)發(fā)揮重要作用。
　　 本研究通過對乙酰膽堿煙堿樣受體的干預觀察腫瘤壞死因子

4、(TNF-α)對EPCs調節(jié)作用的變化，研究闡明TNF-α通過α7nACHR發(fā)揮對EPCs的調節(jié)作用。為各種炎癥、創(chuàng)傷等引起的MODS的臨床預防、早期治療、甚至逆轉MODS病情進展提供理論依據。
　　 本研究分為兩部分，首先從臍靜脈血分離培養(yǎng)內皮祖細胞，并進行鑒定及檢測其增殖、遷移及成血管能力等；其次觀察TNF-α對EPCs的調節(jié)作用受α7nACHR的激動劑及抑制劑的影響，探討腫瘤壞死因子對內皮祖細胞的調節(jié)機制。全文共分兩個部分

5、：
　　 第一部分:臍靜脈血內皮祖細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 目的：從臍靜脈血分離培養(yǎng)內皮祖細胞，為下一步研究打好實驗基礎。
　　 方法：用密度梯度離心法從臍靜脈血中分離出單個核細胞，按照1×106/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿內，使用添加了細胞因子和胎牛血清的內皮祖細胞專用培養(yǎng)液進行誘導分化培養(yǎng)，在固定時間進行消化、傳代和擴增。通過細胞形態(tài)學特征、細胞的超微結構、免疫組化、流式細胞儀技術、乙?；牡兔芏戎鞍?D

6、il-Ac-LDL)和FITC標記的荊豆凝集素-1(FITC-UEA-1)的吞噬功能、體外血管生成功能等方法對其進行鑒定為正在分化的EPCs。Werstern Blot(蛋白免疫印跡法)檢測內皮祖細胞表達α7nACHR。
　　 結果：培養(yǎng)2天后逐漸出現梭形貼壁細胞(attaching cells，ATcells)，第5天逐漸出現貼壁細胞聚集形成集落，到7-9天，貼壁細胞可鋪滿培養(yǎng)皿底。P4代EPCs電鏡觀察可見：細胞內可檢測到典

7、型的Weibel-Palade小體。超過80％體外培養(yǎng)的貼壁細胞都特異性地攝取了Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1。免疫組化結果顯示：CD133(+)、CD34(++)、CD31(+++)、KDR(+++)，CD133(+)、CD34(++)、CD31(+++)、KDR(+++)。流式細胞儀技術鑒定：CD133的陽性率：19.14±4.06％，CD34的陽性率：45.08±6.15％，CD31的陽性率：79.62±11.24％，

8、KDR的陽性率：85.32±12.09％。體外血管生成功能：22.92±8.62個/HP。粘附功能：貼壁率為53.04±4.80％。遷徙功能：遷徙率為14.41±1.65％。增殖功能：7天增殖細胞數是19.16±3.66×104。
　　 結論：以臍靜脈血為來源可以分離培養(yǎng)出的內皮祖細胞數量穩(wěn)定，具有典型內皮祖細胞形態(tài)特點及各種功能，表面表達α7nACHR，為下一步的研究提供技術支持。
　　 第二部分：TNF-α通過α7n

9、ACHR調節(jié)內皮祖細胞功能的研究
　　 目的：旨在探討炎癥介質對EPCs調節(jié)途經是通過煙堿樣乙酰膽堿受體，為臨床應用相關疾病提供理論依據。
　　 方法：實驗選取10個培養(yǎng)皿，均加入TNF-α(100mg/L)，隨機選取其中5個作為A組，依次加入尼古丁(0、10-8、10-6、10-4、10-2mol/L)，標為A1-5；其余5個分為B組，依次加入甲基牛扁亭堿(0、10-8、10-6、10-4、10-2mol/L)，標為B

10、1-5。分別培養(yǎng)T1-3(12h、24h、48h)后行流式細胞儀檢測、Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1攝取實驗、體外血管生成實驗、EPCs增殖功能、粘附功能及遷徙功能檢測。
　　 結果：流式細胞術檢測(陽性率)：A1-A5：CD133:18.67±4.06％，CD34:47.08±7.08％，CD31:82.16±8.89％，KDR：89.02±8.28％；B1-B5：CD133:16.19±6.04％，CD34:48

11、.12±6.34％，CD31:80.43±9.01％，KDR：87.24±9.12％。體外血管生成功能：A1-A5:20.02±4.67個/HP；B1-B5:10.38±7.55個/HP。粘附功能(貼壁率)：A1-A5:48.14±5.78％；B1-B5:29.08±5.12％。遷徙功能(遷徙率)：A1-A5:12.82±1.44％；B1-B5:4.87±0.82％。增殖功能：培養(yǎng)7天增殖細胞數：A1-A5:18.87±4.45×104

12、；B1-B5:4.12±1.02×104。
　　 結論：TNF-α可降低EPCs的增殖、遷移、黏附和體外血管形成能力，且受膽堿受體激動劑及抑制劑影響，TNF-α可能通過乙酰膽堿能通路調節(jié)內皮祖細胞的功能。
　　 小結：機體在炎癥、創(chuàng)傷等過程中，體內EPCs的數量減少及功能障礙可能是導致MODS發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。TNF-α作為重要的炎癥因子在此過程中起到不可或缺的作用。而TNF-α對EPCs數量及功能的調節(jié)，煙堿樣乙