亞低溫誘導MKP-1保護TNF-α引起的內皮細胞屏障功能紊亂和凋亡.pdf

1、研究背景和目的：
　　 臨床研究表明亞低溫療法（32-34℃）在中風、腦損傷、心臟驟停等多種疾病中具有顯著的保護作用。而血管內皮與許多病理過程的發(fā)生發(fā)展關系密切。然而，迄今為止，亞低溫在各種原因引起的內皮細胞損傷中能否起到保護作用以及其中的作用機制尚不明確。因此，本研究擬探討亞低溫在腫瘤壞死因子-α（tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α）引起的內皮細胞屏障功能紊亂和凋亡中的作用及其中的分子機理。

2、　　 實驗方法：
　　 用TNF-α處理人臍靜脈內皮細胞（humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs），再分別放置于正常溫度（37℃）和亞低溫（33℃）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-6小時。用異硫氰酸熒光素標記的牛血清白蛋白（FITC-BSA）體外通透性實驗檢測單層內皮細胞的通透性、用羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽染色法檢測細胞內纖維狀的肌動蛋白（F-肌動蛋白）骨架、用原位末端標記（terminaldUTPni

3、ck-endlabeling，TUNEL）染色法檢測細胞的凋亡。用免疫印記（westernblot）法檢測半胱氨酸蛋白水解酶-3片段（Cleavedcaspaspe-3，Asp175）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）p38、c-Jun氨基末端激酶（c-JunN-terminalkinase，JNK）、熱休克蛋白27（heatshockprotein27，HSP27）、c-Ju

4、n、MAPK激酶3/6（MAPKkinase3/6，MKK3/6）、MAPK激酶7（MAPKkinase7，MKK7）和MAPK磷酸酶-1（MAPKphosphatase-1，MKP-1）的蛋白表達；另外，用p38MAPK特異性抑制劑SB203580或者JNK特異性抑制劑SP600125預處理HUVECs，再進行TNF-α處理，并對上述各項指標進行檢測；同時，將HUVECs不加任何刺激劑放置于亞低溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，再檢測MKP-1的蛋白水

5、平和mRNA水平以及p38MAPK和JNK的蛋白表達；最后用MKP-1的siRNA轉染HUVECs，再進行TNF-α處理，同時檢測各項指標。
　　 實驗結果：
　　 （1）TNF-α處理引起單層HUVECs通透性顯著增強、細胞肌動蛋白骨架重排、和凋亡發(fā)生，而亞低溫能顯著抑制TNF-α引起的這些內皮損傷效應。
　　 （2）亞低溫抑制TNF-α活化的p38MAPK和JNK信號通路。
　　 （3）亞低溫通過抑制

6、p38MAPK/HSP27信號通路減弱TNF-α引起的內皮細胞肌動蛋白骨架的重排和壓力纖維的形成。
　　 （4）亞低溫對內皮細胞凋亡的保護作用是通過抑制p38MAPK和JNK信號通路而實現(xiàn)的。
　　 （5）亞低溫對p38MAPK和JNK的上游激酶MKK3/6和MKK7無明顯影響，但可顯著上調p38MAPK和JNK的上游磷酸酶MKP-1。
　　 （6）siRNA實驗表明，亞低溫通過誘導MKP-1的表達抑制TNF-α