胱氨酸蛋白酶抑制素C對TNF-α-Act D誘導的內(nèi)皮細胞凋亡的保護作用研究.pdf

1、研究背景：胱抑素C(Cystatin C)是半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族2中的成員之一，表達于所有的有核細胞，參與細胞內(nèi)外蛋白水解的調(diào)控，保護細胞免受不適當?shù)膬?nèi)源性或外源性蛋白酶水解。以往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胱抑素C 參與機體許多生理與病理過程，包括腫瘤的侵潤性生長及轉(zhuǎn)移、炎癥的發(fā)生與發(fā)展以及心腦血管疾病等。盡管對胱抑素C的確切生理功能了解不多，但可以確定的是作為半胱氨酸蛋白酶抑制劑，胱抑素C的一個重要生理功能是調(diào)節(jié)組織蛋白酶活性，是目前發(fā)現(xiàn)的

2、對組織蛋白酶B抑制作用最強的內(nèi)源性抑制物。新近研究表明組織蛋白酶B與凋亡存在密切的關(guān)系。
　　 胱抑素C與動脈粥樣硬化密切相關(guān)。炎癥參與了動脈粥樣硬化與動脈瘤的發(fā)生與發(fā)展，發(fā)病機制涉及細胞外基質(zhì)降解與血管壁重構(gòu)。炎癥介質(zhì)的刺激促進血管平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞分泌組織蛋白酶S及K等，使得這類具有促彈性組織離解特性的半胱氨酸蛋白酶在動脈彈力蛋白損傷處過度表達。在動脈粥樣斑塊與腹主動脈瘤組織中發(fā)現(xiàn)胱抑素C含量較正常血管減少，而組織蛋白酶S

3、及K卻過度表達。提示組織蛋白水解酶與其抑制劑在血管壁失平衡可能是動脈粥樣硬化與動脈瘤的發(fā)病機制一。
　　 已有研究證實，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Cystatin C的PC12細胞高表達Cystatin C，在50[％]的O2條件下培養(yǎng)，與正常細胞相比對PC12細胞具有保護作用，并且這種作用與Cystatin C表達的水平正相關(guān)。同時通過其他氧化應激誘導藥物刺激，同樣Cystatin C能夠在氧化應激刺激下保護PC12細胞。同時還發(fā)現(xiàn)在普通環(huán)境下

4、Cystatin C并不能促進PC12細胞增殖?？沟蛲隹赡軝C制：在各種氧化應激刺激下溶酶體失去膜穩(wěn)定性，組織蛋白酶B和D從溶酶體泄漏進細胞質(zhì)中。這些酶可以刺激細胞色素C從線粒體中泄漏并最終導致細胞死亡。由于Cystatin C能夠抑制這些酶的作用，這可能表明Cystatin C通過抑制組織蛋白酶的作用而發(fā)揮抗凋亡作用。
　　 Cystatin C是否對TNF-a/Act D誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡具有保護作用，尚無相關(guān)報道。本研究通

5、過給予內(nèi)皮細胞外源性的Cystatin C和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Cystatin C質(zhì)粒過度表達Cystatin C，研究它們對TNF-a/Act D誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響。
　　 方法：首先克隆Cystatin C基因，構(gòu)建pcDNA3.1-Cystatin C質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染2H-11細胞，通過G418篩選以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。用TNF-a/Act D誘導內(nèi)皮細胞凋亡，通過細胞形態(tài)學觀察，SRB檢測細胞活性，流式細胞儀計數(shù)觀

6、察其凋亡變化，同時Western blot檢測凋亡蛋白Bcl-2，Bax的表達水平。
　　 結(jié)果：通過RT-PCR克隆人Cystatin C基因，構(gòu)建pcDNA3.1-Cystatin C質(zhì)粒。并通過DNA測序確定基因。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染2H-11細胞，Western鑒定，成功得到穩(wěn)定表達株。根據(jù)文獻運用合適的TNF-a/Act D誘導2H-11細胞凋亡，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Cystatin C細胞由TNF-a/Act D誘導的凋