紹興黃酒對同型半胱氨酸誘導(dǎo)的大鼠血管內(nèi)皮細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達的影響.pdf

1、目的:觀察紹興黃酒是否能抑制同型半胱氨酸(Hcy)誘導(dǎo)的大鼠血管內(nèi)皮細胞(VECs)中基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的表達和活性并探討其可能的機制。
　　 方法:大鼠原代主動脈血管內(nèi)皮細胞經(jīng)分離培養(yǎng)及純化鑒定后，取第3～4代細胞用于實驗。將Hcy(0、50、100、500、1000μmol/L)與血管內(nèi)皮細胞共同孵育48 h及100μmol/L Hcy與血管內(nèi)皮細胞共同培養(yǎng)24、48、72 h，分別用熒光定量PCR(FQ-PC

2、R)、免疫印跡法和明膠酶譜法檢測Hcy對培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞MMP-2mRNA、蛋白表達及酶解活性的影響，確定各實驗最佳的Hcy刺激濃度和刺激時間。每種酒(1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0％)與100μmol/L Hcy共同孵育VECs48 h， MTT法檢測各酒精度的酒對血管內(nèi)皮細胞活性的影響，確定各種酒的最佳干預(yù)濃度后，最終干預(yù)組依次分為正常組，Hcy組，Hcy+黃酒組，Hcy+紅葡萄酒組，Hcy+酒精組5組。培養(yǎng)48

3、h后收集各組樣品，F(xiàn)Q-PCR檢測血管內(nèi)皮細胞中MMP-2 mRNA水平，免疫印跡法檢測血管內(nèi)皮細胞中MMP-2蛋白表達量，明膠酶譜法測定血管內(nèi)皮細胞上清液中MMP-2的酶解活性。
　　 結(jié)果:
　　 1.實時熒光定量PCR檢測各組MMP-2 mRNA水平
　　 (1)不同濃度Hcy對VECs MMP-2 mRNA表達的影響:MMP-2 mRNA表達在Hcy濃度為50μmol/L、100μmol/L、500μmo

4、l/L、1000μmol/L時均高于Hcy為0μmol/L(P＜0.01)，當(dāng)Hcy濃度升至500μmol/L時，MMP-2 mRNA表達開始達到最高。
　　 (2) Hcy作用不同時間對VECs MMP-2 mRNA表達的影響:MMP-2 mRNA表達在Hcy(100μmol/L)刺激24 h、48 h、72 h后均高于Hcy刺激0 h(P＜0.01)，且時間升至48h后達到最高。
　　 (3)黃酒和紅葡萄酒干預(yù)對VE

5、Cs MMP-2 mRNA的表達的影響:與Hcy組相比VECs MMP-2 mRNA表達黃酒組和紅酒組分別減少了31.1％和34.5％(P＜0.01)，酒精組減少6.5％(P＞0.05);與酒精組比較，黃酒組與紅酒組MMP-2mRNA水平減少差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);黃酒組和紅酒組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 2.免疫印跡法檢測各組MMP-2蛋白在VECs中的表達量檢測蛋白水平可以發(fā)現(xiàn)，Hcy能夠促進VE

6、Cs MMP-2的表達，在一定范圍內(nèi)可呈現(xiàn)濃度與時間的依賴性。
　　 (1)不同濃度Hcy對VECs MMP-2蛋白表達的影響:Hcy在50～500μmol/L可以促進MMP-2蛋白表達上調(diào)，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 (2)不同作用時間Hcy對VECs MMP-2蛋白表達的影響:Hcy(100μmol/L)干預(yù)24，48，72 h時，可以發(fā)現(xiàn)其促進MMP-2蛋白表達，以48 h最明顯(

7、P＜0.01)。
　　 (3)黃酒和紅葡萄酒干預(yù)對VECs MMP-2表達的影響:相比Hcy組，VECsMMP-2表達在黃酒組和紅酒組分別下降了29.1％和32.6％(P＜0.05)，酒精組下降5.3％(P＞0.05);相比酒精組，黃酒組與紅酒組MMP-2表達下降的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);黃酒組與紅酒組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3.明膠酶譜法檢測MMP-2在上清中的酶解活性明膠酶MMP-2在

8、體內(nèi)以酶原的形式進行合成與分泌，并在細胞外進行激活。用酶解明膠的量表示MMP-2的酶解活性的強弱，Hcy在50～500μmol/L時可以增強MMP-2的活性，隨著Hcy濃度增強MMP-2酶解活性增強，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。Hcy（100μmol/L）干預(yù)24，48，72 h，可以發(fā)現(xiàn)隨著時間增加其促進MMP-2活性增強，并以48 h最明顯(P＜0.01)。在最終的黃酒和紅酒干預(yù)組中，與Hcy組相比，MMP-

9、2活性黃酒組和紅酒組分別下降了31.2％和33.8％(P＜0.05)，酒精組下降4.6％(P＞0.05);黃酒組、紅酒組MMP-2活性下降與酒精組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);黃酒組與紅酒組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.Hcy能增強大鼠血管內(nèi)皮細胞MMP-2表達及酶解活性，在一定范圍內(nèi)隨著Hcy濃度和刺激時間的增強而增強，可能在動脈粥樣硬化發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。
　　 2.