人工體神經(jīng)-內(nèi)臟神經(jīng)反射弧手術(shù)修復(fù)神經(jīng)源性膀胱尿路上皮滲透性屏障的可行性研究.pdf

1、第一部分神經(jīng)源性膀胱模型制作及人工體神經(jīng)-內(nèi)臟神反射弧手術(shù)后再生神經(jīng)形態(tài)學(xué)研究
　　目的:觀察人工體神經(jīng)-內(nèi)臟神反射弧手術(shù)后再生神經(jīng)纖維的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和膀胱輸尿管形態(tài)。
　　方法:清潔級(jí)雌性SD大鼠60只(120~160)隨機(jī)分為三組:端端吻合組(n=20),在腰4水平切斷兩側(cè)L4VR、L6VR和S1VR神經(jīng),將L6VR與L4VR行端端吻合。損傷未吻合組(n=20),切斷兩側(cè)L6VR和S1VR神經(jīng),不進(jìn)行神經(jīng)端端吻合術(shù)。對(duì)照組

2、(n=20),切斷兩側(cè)S1VR神經(jīng)。手術(shù)16周后,沿大鼠背側(cè)原切口找到L4VR-L6VR神經(jīng)端端吻合口,在體視顯微鏡下取下距吻合口10-20mm處取10mm長再生L6神經(jīng)段行1μm半薄切片甲苯胺藍(lán)染色后統(tǒng)計(jì)再生神經(jīng)纖維數(shù)量及電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)形態(tài);肉眼觀察三組大鼠膀胱形態(tài)并測(cè)量膀胱殘余尿量,在體視顯微鏡下觀察三組大鼠輸尿管形態(tài)。
　　結(jié)果:超微病理顯示在端端吻合組再生L6神經(jīng)前根可見大量的有髓神經(jīng)纖維和雪旺氏細(xì)胞;半薄切片甲苯胺藍(lán)染

3、色顯示再生L6VR中有髓神經(jīng)纖維平均數(shù)量為700.4±50.7。肉眼觀察可見端端吻合組大鼠膀胱形態(tài)正常殘余尿0.7±0.9ml,輸尿管無擴(kuò)張,而未吻合組大鼠可見膀胱增大,殘余尿可達(dá)14.2±5.6ml,輸尿管明顯擴(kuò)張;對(duì)照組大鼠膀胱形態(tài)正常有少許殘余尿平均約為0.3±0.2ml無輸尿管擴(kuò)張。
　　結(jié)論:我們成功構(gòu)建了神經(jīng)源性膀胱和人工體神經(jīng)-內(nèi)臟神反射弧手術(shù)大鼠模型,L4VR和L6VR行端端吻合后L4VR運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突可以長入L6

4、VR,再生的L6VR可見大量的再生有髓神經(jīng)纖維和雪旺氏細(xì)胞。
　　第二部分人工體神經(jīng)-內(nèi)臟神反射弧手術(shù)重建膀胱神經(jīng)支配的逆行神經(jīng)追蹤和膀胱測(cè)壓研究
　　目的:應(yīng)用逆行神經(jīng)追蹤技術(shù)研究人工體神經(jīng)-內(nèi)臟神經(jīng)反射弧手術(shù)后的神經(jīng)再生并利用膀胱測(cè)壓技術(shù)研究膀胱能否重新獲得有功能的神經(jīng)支配。
　　方法:清潔級(jí)雌性SD大鼠60只(120~160g)隨機(jī)分為三組:端端吻合組(n=20),切斷兩側(cè)L4VR、L6VR和S1VR神經(jīng),將L6

5、VR與L4VR行端端吻合。損傷未吻合組(n=20),切斷兩側(cè)L6VR和S1VR神經(jīng),不進(jìn)行神經(jīng)端端吻合術(shù)。對(duì)照組(n=20),切斷兩側(cè)S1VR神經(jīng)。手術(shù)16周后,取端端吻合組、損傷未吻合組和對(duì)照組各10只,將熒光金(Fluorogold,FG)1μl注射至兩側(cè)盆神經(jīng)節(jié),大鼠存活7天后4％多聚甲醛灌注固定,取L4、L6和S1脊髓節(jié)段行冰凍切片并在熒光顯微鏡下觀察被熒光標(biāo)記的神經(jīng)元。另取端端吻合組、損傷組及對(duì)照組各10只分別手術(shù)顯露L4VR

6、-L6VR吻合口、L6VR殘端及正常L6后將自制膀胱測(cè)壓管置于三組大鼠膀胱內(nèi)分別連接微量灌注泵和BL-410生物機(jī)能采集系統(tǒng),電刺激已游離的神經(jīng)后測(cè)量膀胱壓力。
　　結(jié)果:逆行追蹤結(jié)果顯示在端端吻合組L4脊髓節(jié)段切片兩側(cè)可見大量FG標(biāo)記神經(jīng)元,在L6和S1脊髓節(jié)段中均未見FG標(biāo)記神經(jīng)元;在損傷未吻合組中L4、L6和S1脊髓節(jié)段中均未見FG標(biāo)記神經(jīng)元;在對(duì)照組中在L6脊髓節(jié)段中可見少量雙側(cè)FG標(biāo)記神經(jīng)元,在L4及S1脊髓節(jié)段中均未見

7、FG標(biāo)記神經(jīng)元。膀胱測(cè)壓結(jié)果顯示:端端吻合組電刺激供體神經(jīng)L4VR可以觀察到膀胱壓力先迅速升高到峰值,然后伴隨著尿液排出,壓力快速下降到基線水平,與對(duì)照組相類似;而刺激L6VR可見膀胱壓力隨著持續(xù)的膀胱灌注緩慢升高并保持在基線水平,而無明顯的波幅形成
　　結(jié)論:人工體神經(jīng)-內(nèi)臟神反射弧手術(shù)后L4VR可再生長入L6VR并重新支配盆神經(jīng)節(jié)并且膀胱可獲得有功能的神經(jīng)支配。
　　第三部分神經(jīng)源性膀胱行人工體神經(jīng)—內(nèi)臟神經(jīng)反射弧手術(shù)后

8、膀胱尿路滲透性屏障的功能研究
　　目的:本實(shí)驗(yàn)利用普通HE染色、免疫熒光、電鏡及實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究大鼠膀胱尿路上皮滲透性屏障功能
　　方法:清潔級(jí)雌性SD大鼠60只(120~160g)隨機(jī)分為三組:A端端吻合組(n=20),切斷兩側(cè)L4、L6和S1神經(jīng)前根,將L6VR與L4VR行端端吻合。B損傷未吻合組(n=20),切斷兩側(cè)L6和S1神經(jīng)前根,不進(jìn)行神經(jīng)端端吻合術(shù)。C對(duì)照組(n=20),切斷兩側(cè)S1神經(jīng)前根。手術(shù)16周后

9、,取膀胱分別行普通HE染色;uroplakinⅢ、AQP3、ZO-1免疫熒光染色,尿路上皮電鏡研究及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)膀胱炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的變化。
　　結(jié)果:HE染色顯示端端吻合組和對(duì)照組大鼠膀胱尿路上皮結(jié)構(gòu)層次清晰,未吻合組大鼠膀胱尿路上皮普遍存在死亡傘細(xì)胞。免疫熒光染色顯示三組中ZO-1表達(dá)沒有顯著性差異,在端端吻合組和對(duì)照組大鼠膀胱尿路上皮AQP-3主要表達(dá)于尿路上皮基底膜,而在未吻合組中AQP3

10、表達(dá)于尿路上皮全層,uroplakinⅢ染色中顯示尿路上皮傘細(xì)胞層被破壞。尿路上皮電鏡研究顯示:端端吻合組和對(duì)照組大鼠膀胱尿路上皮中沒有中性粒細(xì)胞浸潤,緊密聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)清晰,傘細(xì)胞頂壁含有大量梭狀囊泡,而未吻合組大鼠膀胱尿路上皮中出現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤,緊密聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)模糊,含有大圓盤狀囊泡。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示未吻合組大鼠膀胱中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)明顯高于端端吻合組和對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:人