用基因芯片技術(shù)尋找新的肝癌早期診斷標(biāo)記物的研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(簡稱肝癌)是常見惡性腫瘤，預(yù)后差，其5年生存率通常不超過5％。預(yù)后差的原因之一是多數(shù)患者未能做到早期診斷和早期治療，而早診早治是改善肝癌預(yù)后最重要因素這一觀點(diǎn)已被公認(rèn)。 甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是唯一廣泛使用的肝癌診斷血清標(biāo)記物，然而約三分之一的肝癌患者不伴有血清AFP升高，在腫瘤直徑小于5厘米的小肝癌患者伴有血清AFP升高的比例更低。另外15—58％的慢性肝炎患者和¨一47％的肝硬化患者

2、可伴有AFP水平的非特異性升高，而75—90％的肝癌發(fā)生在硬化的肝臟。因此，迫切需要尋找有較高特異度和靈敏度的新肝癌早期診斷標(biāo)記物，這對(duì)AFP陰性肝癌和小肝癌患者尤為重要。 一、用基因芯片技術(shù)篩選肝癌組織中高表達(dá)基因 為此目的，本課題使用基因芯片分析技術(shù)對(duì)218例肝癌患者的基因表達(dá)譜進(jìn)行了分析。通過對(duì)高AFP水平(AFP_~300ng／m1)肝癌患者和低AFP水平(AFP<300ng／m1)肝癌患者的基因表達(dá)譜比較分析，

3、尋找在肝癌患者中，包括那些AFP陰性(AFP≤20ng／m1)肝癌患者和低AFP水平(AFP>20-<300ng／m1)肝癌患者中高表達(dá)的基因。經(jīng)過比較分析，得到46個(gè)在肝癌患者腫瘤組織中平均表達(dá)水平大于等于2的基因。隨后對(duì)這46個(gè)基因進(jìn)行比較分析和篩選，選擇的標(biāo)準(zhǔn)主要有：1)這些基因在肝癌組織中，包括那些AFP陰性和低AFP水平的肝癌組織中高表達(dá)；2)這些基因編碼的蛋白質(zhì)為分泌性蛋白或者比較新，可能在血清中或者血漿中發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行定量分析

4、。據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，在46個(gè)高表達(dá)基因中選擇了5個(gè)基因進(jìn)行下一步的驗(yàn)證和分析，這5個(gè)基囚分別是：GPC3，PEGlO，MDK，SERPINll和QP-C。 二、刖實(shí)時(shí)定量PCR分析技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證分析 隨后，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR分析技術(shù)對(duì)這5個(gè)基因分別在50例AFP陰性和8例AFP陽性的肝癌組織、1O例肝癌患者癌旁無瘤肝硬化組織以及26例單純肝硬化患者肝臟組織中的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行了分析和驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)這5個(gè)基因在人多數(shù)肝癌組織，包括那些A

5、FP陰性的肝癌患者，小肝癌患者腫痛組織中的表達(dá)水平顯著升高。這5個(gè)基因：GPC3，PEGlO，MDK，SERPINll和QP-C在肝痛組織中的平均相對(duì)表達(dá)水平分別為26．9，23．8，40．2，6．2和4．8；而在肝硬化肝臟組織中的平均相對(duì)表達(dá)水平分別為0．2，0．2，1．4，¨和0．8，所有5個(gè)基因在兩組間的表達(dá)水平都有顯著性差異(p

6、組織和36例肝硬化組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，按照每個(gè)基因在36例肝硬化組織中的平均表達(dá)水平加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差(M+2SD)來計(jì)算該基因的正常表達(dá)水平閡值，然后在肝癌組織和肝硬化組織中統(tǒng)計(jì)表達(dá)水平高于該正常閾值的病例數(shù)和百分比，結(jié)果顯示65．5％一84．5％的肝癌組織5個(gè)基因表達(dá)水平高于閾值，而在肝硬化組織中表達(dá)水平高于閾值的僅為2．8％一5．6％。 用PAM(PredictionAnalysisofMicroarray)軟件對(duì)其表

7、達(dá)數(shù)據(jù)作進(jìn)一步分析，這5個(gè)基因作為潛在診斷標(biāo)記物在肝癌組織中的診斷預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為84．5％(49／58)，在AFP陰性的肝癌患者中的診斷預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為82％(41／50)，在小肝癌患者中的診斷預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為87．5％(35／40)。依據(jù)這5個(gè)基因的差異表達(dá)可以準(zhǔn)確地將肝癌組織(84．5％,49／58)和肝硬化的肝臟組織(100％,36／36)區(qū)分開。 根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果和PAM軟件分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)GPC3，PEGl0和MDK在其

8、中起主要作用，其所占預(yù)測(cè)權(quán)重較大。此外，對(duì)5個(gè)基因的不同組合方式診斷預(yù)測(cè)分析準(zhǔn)確性進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)由于這些肝癌診斷標(biāo)記物之間可以有互補(bǔ)作用，因此多個(gè)診斷標(biāo)記物聯(lián)合應(yīng)用可以增加其診斷預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。 三、血清標(biāo)本midkine酶聯(lián)免疫吸附分析 目前已知GPC3，MDK和SERPINll編碼的產(chǎn)物是存在于血清中的已知蛋白質(zhì)。由于目前僅MDK編碼的蛋白質(zhì)midkine有已經(jīng)開發(fā)好的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒，故用ELISA

9、試劑盒對(duì)另外64例肝癌患者和26例正常人血清標(biāo)本中midkine的濃度進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在肝癌患者中血清midkine水平中位數(shù)(25％和75％位數(shù))為442．8(288和666．5)pg／ml，而正常人血清中midkine水平中位數(shù)(25％和75％位數(shù))僅為¨．65(3．83和42．3)pg／ml，兩組問血清midkine水平有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(p<0．0001，unpairedttestwithWelch’scorrection)，在

10、肝癌患者中，包括那些AFP陰性的肝癌患者[中位數(shù)(25％和75％位數(shù))為445．6(381．9，673．4)pg／ml]和小肝癌患者[中位數(shù)(25％和75％位數(shù))為392．1(250．9，549．3)pg／m1]，血清midkine水平比正常人顯著升高。 按照存26例正常人血清中midkine濃度的平均值加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)籌(M+2SD)來計(jì)算其正常表達(dá)水平閾值，然后在肝癌病例和正常人中統(tǒng)計(jì)midkine濃度高于該正常閾值的例數(shù)和百

11、分比，結(jié)果100％(64／64)的肝痛病例其血清midkine濃度高于閾值，而在正常人則僅有7．7％(2／26)高于閾值。 而對(duì)不同AFP水平肝癌病例進(jìn)行分組并對(duì)其血清midkine水平進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)在AFP陰性肝癌(AFP<20ng／m1)、低AFP水平(20ng／ml300ng／m1)肝癌病例組的血清midkine水平無顯著差異(p=0．96，one-wayANOV

12、A)。依據(jù)腫瘤直徑大小對(duì)肝癌病例進(jìn)行分組并對(duì)其血清midkine水平進(jìn)行比較分析，同樣發(fā)現(xiàn)在腫瘤直徑<3cm的肝癌病例、3cm<腫瘤直徑_<5cm的肝癌病例和腫瘤直徑>5cm的肝癌病例組的血清midkine水平無顯著差異(p=0．22，one-wayANOVA)。 根據(jù)腫瘤大小將64例肝癌病例分為兩組，腫瘤直徑小于5cm的小肝癌組(29例)和腫瘤直徑大于等于5cra的大肝癌組(35例)，對(duì)這兩組肝癌病例血清中AFP和midkin

13、e水平進(jìn)行比較分析。大肝癌組血清AFP水平中位數(shù)(25％和75％位數(shù))為1634(21．85和41910)ng／ml，小肝癌組AFP水平中位數(shù)(25％和75％位數(shù))為74．3(¨和477)ng/ml，兩組間的AFP水平有顯著差異(p=O．02，nonparametricMannWhitneytests)，提示肝癌病例的血清AFP水平與腫瘤大小相關(guān)；而大肝癌組血清midkine水平中位數(shù)(25％和75％位數(shù))為553．1(373．3和68

14、2．8)pg／ml，小肝癌組血清midkine水平中位數(shù)(25％和75％位數(shù))為392．1(250．9和549．3)pg／ml，兩組間血清midkine水平無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0．05，nonparametricMannWhitneytests)。因此，肝癌病例血清AFP水平的高低可能反映腫瘤大小，而不同腫瘤大小的肝癌病例其血清中midkine水平均顯著升高，且無顯著差異。由于小肝癌患者其血清AFP水平相對(duì)較低，診斷特異性較差，我們可

15、以利用其血清midkine水平來進(jìn)行AFP陰性肝癌病例和小肝痛的早期診斷。 本研究的結(jié)果表明，這5個(gè)基因作為新的潛在肝癌早期診斷輔助標(biāo)記物，對(duì)肝癌患者，包括那些AFP陰性肝癌，低AFP水平肝癌和小肝癌患者具有較高的靈敏度和特異度，值得進(jìn)一步深入研究。如將其與AFP聯(lián)合應(yīng)用在肝癌診斷和肝癌手術(shù)治療后的隨訪中，可以提高肝癌患者，尤其是AFP陰性的肝癌患者，低AFP水平肝癌患者及小肝癌患者的早期診斷率和診斷準(zhǔn)確率，使更多肝癌患者能夠做