血清長鏈非編碼RNAs作為伴乙肝肝癌早期診斷標記物的研究.pdf

1、研究背景：
　　 原發(fā)性肝細胞癌(HCC)是全球第五位最常見的惡性腫瘤，也是近年來發(fā)病率上升最快、病死率最高的腫瘤之一。在我國，HBV的高感染性導(dǎo)致慢性肝病、肝硬化的高發(fā)性。據(jù)研究報道慢性HBV感染者一生中有10-25％的機率發(fā)展為HCC。因此從HBV感染到最終的肝癌，其間為早期診斷和早期發(fā)現(xiàn)提供了可能。目前常用的高危人群篩查指標是血清甲胎蛋白(AFP)檢測及超聲檢查。AFP是目前公認的唯一可用于臨床HCC高危人群篩選及術(shù)后隨訪

2、的肝癌腫瘤標志物，但臨床研究表明其敏感性僅36-64％，特異性為79-91％，有1/3左右的HCC可表現(xiàn)為AFP正常，即使AFP升高者，也不能排除慢性肝病、肝硬化等非惡性肝病。超聲檢查通常難以發(fā)現(xiàn)、確認小于3cm的腫塊，且超聲醫(yī)師個體診斷水平的差異對診斷結(jié)果有很大影響，上述現(xiàn)狀導(dǎo)致HCC難以實現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)和早期治療，患者預(yù)后差、5年生存率低、病死率高。因此尋找有效的早期篩查及診斷指標對提高肝癌的整體診治水平迫在眉睫。循環(huán)核酸(cfCNA)

3、是一類存在于血液、尿液、腦脊液等循環(huán)系統(tǒng)中的RNA和DNA，目前已有研究證實循環(huán)核酸和疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，通過探測循環(huán)核酸可以達到診斷疾病的目的，尤其對于腫瘤，如已有研究證實血清中的MiroRNA可以用作多種疾病的診斷。
　　 研究目的：
　　 分析來源于伴乙肝肝癌組織和癌旁組織中特異性表達的lncRNAs，篩選出癌組織中高表達的lncRNAs分子，通過在正常人、乙肝患者及伴乙肝肝癌患者血清中定量驗證篩選出的l

4、ncRNAs的表達情況，從而探討血清中的lncRNAs是否可以作為肝癌早期診斷的標記物。
　　 研究方法：
　　 第一部分:lncRNAs在伴乙肝肝癌組織及癌旁組織中的表達及目的lncRNAs的挑選利用5對伴乙肝肝癌組織及癌旁組織做基因芯片，建立伴乙肝肝癌組織中特異表達的lncRNAs譜（差異倍數(shù)＞2倍，P＜0.05）。然后隨機挑選其中的5個分子在68對伴乙肝肝癌組織和癌旁組織中驗證組織芯片的可靠性，最后從特異性表達的

5、lncRNAs中我們挑選了升高倍數(shù)＞5倍的lncRNAs作為我們的候選分子，通過150例血清樣本（正常血清、乙肝患者血清及伴乙肝肝癌患者血清）的驗證，找出血清中存在的，有可能作為早期診斷標記物的lncRNAs作為目標分子。
　　 第二部分:回顧性大樣本量探索目標分子在血清中的表達情況通過回顧性的、大樣本的在正常人血清、乙肝患者血清、伴乙肝肝癌患者血清中驗證目標分子的表達情況，探討目標分子作為伴乙肝肝癌早期診斷標記物的可能性、特異

6、性及敏感性，建立使用目標分子作為伴乙肝肝癌早期診斷標記物的診斷模型。
　　 第三部分:前瞻性驗證回顧性數(shù)據(jù)得出的診斷模型的診斷效率應(yīng)用回顧組建立的診斷模型前瞻性的驗證適量樣本（正常人血清、乙肝患者血清及伴乙肝肝癌患者血清），從而評估該診斷模型的診斷效率以及應(yīng)用與臨床實踐的潛在可能性。
　　 研究結(jié)果：
　　 第一部分:基因芯片結(jié)果顯示伴乙肝肝癌組織和癌旁組織之間存在大量差異表達的lncRNAs。通過在伴乙肝肝癌組

7、織和癌旁組織中隨機驗證5個lncRNAs分子，結(jié)果與芯片結(jié)果一致。在差異表達的的lncRNAs中升高倍數(shù)（癌組織vs.癌旁組織）＞5倍的lncRNAs共有23個，通過在三組血清標本（正常血清、乙肝患者血清及伴乙肝肝癌患者血清）中定量驗證這23個lncRNAs分子，經(jīng)過對PCR產(chǎn)物進行基因測序證實所得產(chǎn)物序列與目標分子序列一致。進一步統(tǒng)計分析顯示其中兩個分子(lncRNA-uc003wbd，lncRNA-AF085935)有統(tǒng)計學(xué)意義(p

8、＜0.05)。因此，我們將lncRNA uc003wbd，lncRNA-AF085935選定為目標分子進行下一步研究。
　　 第二部分:通過在三組樣本中（正常血清、乙肝患者血清、肝癌患者血清）回顧性驗證lncRNA-uc003wbd，lncRNA-AF085935的表達情況，Real time-PCR結(jié)果顯示lncRNA-uc003wbd，lncRNA-AF085935在三組樣本中的表達均呈肝癌患者血清＞乙肝患者血清＞正常血清的

9、趨勢，且均有統(tǒng)計學(xué)意義，lncRNA-uc003wbd，lncRNA-AF085935診斷肝癌時ROC曲線下的面積分別為:0.8597，95％可信區(qū)間為0.8221～0.8974，0.8702，95％可信區(qū)間為0.8309～0.9095。以此結(jié)果我們利用logitic回顧模型建立了以lncRNA-uc003wbd，lncRNA-AF085935為基礎(chǔ)的診斷模型:Logit(P=HCC)=-6.859+0.719* uc003wbd+1.

10、804* AF085935，回顧性數(shù)據(jù)顯示該模型具有良好的早期診斷效率，應(yīng)用此模型區(qū)分肝癌患者、乙肝患者及正常人的ROC曲線下面積為:AUC=0.9432，95％可信區(qū)間為0.9195～0.9668; Sensitivity:69.63，Specificity:95.88。
　　 第三部分:Real time-PCR結(jié)果顯示，在前瞻性觀察的隊列中應(yīng)用以回顧組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)建立的診斷模型具有較好的診斷效率，該模型可以較好的區(qū)分肝癌患者

11、、乙肝患者及正常人群(AUC=0.9496，95％可信區(qū)間為0.9201～0.9791;Sensitivity:65.57，Specificity:99.17)，該模型有可以應(yīng)用與臨床實踐的潛在可能。
　　 結(jié)論：
　　 1、伴乙肝肝癌組織和癌旁組織中具有特異的lncRNAs表達譜。
　　 2、血清中存在腫瘤來源的lncRNAs分子。
　　 3、以lncRNA-、lncRNA-為基礎(chǔ)建立的肝癌早期診斷模型