長鏈非編碼RNAs對原發(fā)性肝癌預(yù)后評估及治療指導(dǎo)作用的研究.pdf

1、研究背景
　　 肝癌是在全世界腫瘤發(fā)病中居第五位，在致死性腫瘤中則位居第三。在全世界，每年因肝癌導(dǎo)致的死亡患者中，有近一半發(fā)生在我國。盡管近年來肝癌的診斷和治療有了很大提高，但是，鑒于其較高的復(fù)發(fā)率和門靜脈侵犯等原因，肝癌的預(yù)后仍較差。此外，肝癌的發(fā)病機(jī)制也是很不清楚。最近的研究顯示在許多組織異常表達(dá)的長鏈非編碼RNAs(long noncoding RNAs，lncRNAs)在腫瘤形成過程中有重要作用。如此為肝癌的相關(guān)研究又增

2、添了一個切入點(diǎn)。
　　 研究目的
　　 分析來源于肝癌門靜脈癌栓細(xì)胞系(CSQT-2)特異性表達(dá)的lncRNA，尋找與肝癌轉(zhuǎn)移和門靜脈癌栓形成密切相關(guān)的lncRNAs，探討肝癌轉(zhuǎn)移和門靜脈癌栓的發(fā)生機(jī)制并為肝癌及門靜脈癌栓的治療尋找新的靶點(diǎn)。
　　 研究方法
　　 第一部分：lncRNAs在不同轉(zhuǎn)移能力細(xì)胞系中的表達(dá)及目的基因的挑選
　　 利用不同轉(zhuǎn)移能力的肝癌細(xì)胞系CSQT-2和Hep3B做基因

3、芯片，建立高轉(zhuǎn)移能力細(xì)胞系特異表達(dá)的lncRNAs譜和mRNAs譜(差異倍數(shù)＞2倍，P＜0.05)。因為lncRNAs為非編碼RNAs，多通過調(diào)節(jié)mRNAs的表達(dá)發(fā)揮作用，并且lncRNAs通過與其相關(guān)的mRNAs結(jié)合成雙連而發(fā)揮作用是一個重要的方式，所以，本研究首先尋找與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的mRNAs，再根據(jù)堿基序列分析結(jié)果尋找與這些mRNA有關(guān)的lncRNAs，從而確定目的lncRNAs。
　　 第二部分：目的基因?qū)SQT-2細(xì)

4、胞系遷移能力的影響的研究
　　 在不同轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞系中(CSQT-2，MHCC97-H，MHCC97-L，HepG2，Hep3B)進(jìn)一步用qRT-PCR檢測目的基因的表達(dá)情況。用RNAi技術(shù)對目的lncRNAs進(jìn)行干擾，觀察lncRNAs相關(guān)的mRNAs及下游蛋白的改變情況。再通過細(xì)胞遷移實驗(transwellarray)驗證目的lncRNAs對細(xì)胞遷移能力的影響。
　　 第三部分：目的基因在不同人群中的不同組織中的

5、表達(dá)及其與預(yù)后關(guān)系的研究
　　 在三種不同人群(A組：肝癌伴癌栓，n=245；B組：肝癌伴或不伴癌栓，n=372；C組：肝癌術(shù)后索拉菲尼治療，n=38)的不同組織(癌栓，原發(fā)灶，癌旁)中檢測目的lncRNAs的表達(dá)情況，結(jié)合隨訪結(jié)果探討目的lncRNAs與患者預(yù)后的關(guān)系。并通過ROC分析評價目的lncRNAs對患者預(yù)后評估作用的強(qiáng)度。
　　 研究結(jié)果
　　 第一部分：基因芯片結(jié)果顯示CSQT-2和Hep3B細(xì)胞系

6、之間存在大量差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs。其中許多與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的分子均高表達(dá)。ICAM1(NM_000201)作為重要的與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的分子在CSQT-2細(xì)胞系中為高表達(dá)(12.7倍)，進(jìn)一步的基因序列分析發(fā)現(xiàn)ICAM1與BX648637(ASLNC24236，lncRNA)多達(dá)819個連續(xù)互補(bǔ)的堿基；同時BX648637在CSQT-2細(xì)胞系中也為高表達(dá)(14.8倍)。故以ICAM1與BX648637作為目的基因進(jìn)行下一步的研

7、究，并將lncRNA-BX648637定義為轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNA(metastasisrelationlongnoncodingRNA，MeRL)。
　　 第二部分：qRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)移能力高的細(xì)胞系(CSQT-2，MHCC97-H)中MeRL與ICAM1的表達(dá)高，與基因芯片結(jié)果相符。RNA酶保護(hù)實驗(RPA)結(jié)果顯示，MeRL與ICAM1之間的互補(bǔ)區(qū)域可形成RNA雙聯(lián)結(jié)構(gòu)。RNAi結(jié)果顯示，在CSQT-2中隨著MeRL

8、的表達(dá)的降低，ICAM1及其相關(guān)的蛋白均明顯下降，CSQT-2細(xì)胞的遷移能力也下降；同時，在Hep3B細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染二者互補(bǔ)序列后，ICAM1及其相關(guān)的蛋白均明顯升高，Hep3B細(xì)胞的遷移能力也明顯增強(qiáng)。
　　 第三部分：qRT-PCR結(jié)果顯示，在不同組織中的MeRL與ICAM1表達(dá)不同。在癌栓患者中癌栓組織的MeRL與ICAM1明顯高于原發(fā)灶；而肝癌不伴癌栓的患者中原發(fā)灶中MeRL與ICAMl表達(dá)要高于癌旁。結(jié)合隨訪結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌

9、栓組織中MeRL與ICAM1高表達(dá)的癌栓患者(A組)及原發(fā)灶高表達(dá)的肝癌患者(B組，伴或不伴癌栓)的預(yù)后要遠(yuǎn)差與低表達(dá)患者，這其中又以MeRL與ICAM1同時高表達(dá)的患者預(yù)后最差。同時，在B組患者中MeRL與ICAM1的表達(dá)越高，其腫瘤越大(P＜0.001，P=0.0109)，TNM分期越差(P=0.001，P＜0.001)，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的幾率越高(P＜0.001，P=0.0265)；MeRL高表達(dá)的患者癌栓的發(fā)生率也高(P=0.001)。

10、在C組患者中(肝癌術(shù)后接受索拉菲尼治療)，MeRL高表達(dá)組患者預(yù)后明顯比低表達(dá)組差。
　　 結(jié)論
　　 1、不同轉(zhuǎn)移能力的肝癌細(xì)胞系具有特異的IncRNAs表達(dá)譜。
　　 2、MeRL可通過與ICAM1結(jié)合成RNA雙鏈結(jié)構(gòu)增強(qiáng)器穩(wěn)定性并促進(jìn)其高表達(dá)，進(jìn)而增加細(xì)胞的遷移能力。
　　 3、MeRL，高表達(dá)的HCC腫瘤惡性程度高，患者預(yù)后差、對索拉菲尼的治療不敏感。
　　 本課題創(chuàng)新點(diǎn)及潛在應(yīng)用價值