Math1誘導體外聽覺感覺上皮再生.pdf

1、目的：
　　1）誘導耳蝸非感覺上皮產(chǎn)生異位新生毛細胞;
　　2）在個體細胞水平上對比新生的異位毛細胞與固有毛細胞的異同;
　　3）觀察細胞間相互作用對新生感覺細胞細胞命運的影響;
　　4）從整個非感覺上皮區(qū)觀察異位新生感覺細胞群體的運動軌跡，與固有Corti器感覺上皮發(fā)育過程之間的共同點，暨發(fā)育中匯聚伸展現(xiàn)象在體外再生過程中的重現(xiàn);
　　5）探索新生感覺細胞相互作用及群體匯聚遷移運動的可能因素。
　　

2、方法：本實驗以新生大鼠為研究對象。應(yīng)用耳蝸基底膜體外培養(yǎng)技術(shù)，體外構(gòu)建表達EGFP綠色熒光蛋白標記物或及表達math1基因的腺病毒載體(Ad-EGFP，Ad-EGFP-math1)，感染基底膜，使被感染細胞過度表達math1基因，從而在非感覺上皮區(qū)產(chǎn)生異位新生毛細胞;應(yīng)用免疫熒光組織化學技術(shù)分析受感染細胞到新生毛細胞或新生支持細胞的命運轉(zhuǎn)化，分析新感覺細胞個體及群體的遷移特點;利用掃描電子顯微鏡、熱場發(fā)射電子顯微鏡，觀察在誘導細胞轉(zhuǎn)化過

3、程中非感覺上皮區(qū)細胞形態(tài)的轉(zhuǎn)變、尤其是纖毛的再生過程，毗鄰細胞之間的相互作用，以及整個上皮細胞區(qū)的移動;采用半透膜共培養(yǎng)體系以及同皿共培養(yǎng)體系，觀察耳蝸不同部位組織之間的相互作用，初步探討再生感覺細胞上皮群體移動的信號的來源和傳遞方式，及其從耳蝸底圈到頂圈的運動差異;以倒置熒光顯微鏡觀察培養(yǎng)中的組織及其熒光標記，以正置熒光顯微鏡及共聚焦顯微鏡采集組織鋪片的抗體熒光標記;以活細胞熒光實時監(jiān)測系統(tǒng)監(jiān)測組織中細胞的群體移動。
　　結(jié)果：

4、1）體外培養(yǎng)的耳蝸基底膜的非感覺上皮細胞，包括Corti器內(nèi)側(cè)的大上皮嵴區(qū)(Greater epithelial region，GER)和Corti器外側(cè)體外增殖的非感覺細胞區(qū)(lateral non-sensory region，LNSR)，過表達math1基因均可以產(chǎn)生異位新生的毛細胞，但GER區(qū)與LNSR區(qū)在感染編碼math1的腺病毒后產(chǎn)生新生毛細胞的過程不盡相同;
　　2）這些新生毛細胞與固有毛細胞高度相似，共同特點有:細

5、胞呈圓形或梨形的立體形態(tài)，毛細胞的特異性分子標志物myosinⅦa陽性，具有表皮板，有形態(tài)近似成熟的靜纖毛束，能形成長而粗大的動纖毛;
　　3）靜纖毛束的產(chǎn)生過程，是單根纖毛從延長的細胞表面微絨毛形態(tài)，到具有纖細堅韌的根部、直立的體部和紡錘尖的頂部形態(tài)的靜纖毛，從倒伏彎曲到束狀直立在毛細胞頂部，并形成有梯度排列的靜纖毛束，期間伴隨著靜纖毛間的側(cè)連接由無到有，再由多到少的過程。梯度排列的靜纖毛之間可見頂連接。有的新生毛細胞可見動纖毛

6、;
　　4）部分感染編碼math1基因腺病毒的細胞轉(zhuǎn)化為新的支持細胞，表現(xiàn)為細胞形態(tài)由扁平變?yōu)榱Ⅲw，呈杯狀或滲出指狀突起，包繞鄰近新生毛細胞;毛細胞標記物myosin7a呈陰性，而支持細胞的標記物GFAP呈陽性。同時新生的支持細胞能夠轉(zhuǎn)移到在結(jié)構(gòu)上與其密切相關(guān)的新生毛細胞的下層，正如固有的毛細胞和支持細胞一樣，被感染的上皮趨向于形成上下兩層細胞的聽覺感覺上皮結(jié)構(gòu)，將其合稱為新生毛細胞-支持細胞單位;
　　5）新生的感覺細胞能

7、夠運動和遷移，整合入Corti器固有毛細胞中。GER的新生毛細胞以個體細胞的方式插入Corti器;而LNSR的新生毛細胞則表現(xiàn)為細胞群體從最外側(cè)向內(nèi)側(cè)蝸軸方向變窄、遷移，最終集體整合入Corti器的外毛細胞，固有外毛細胞也在被插入的過程中受到影響而重新排列，這一過程與發(fā)育中感覺上皮的平面細胞極性匯聚伸展的特點高度相似;
　　6）LNSR新生感覺上皮的遷移過程，在同樣的時間，靠近耳蝸基底端的比靠近蝸尖的組織變窄更快，且更早的整合入C

8、orti器。在共培養(yǎng)條件下，靠近基底段的組織，能夠吸引基底段和蝸尖段產(chǎn)生的LNSR新生感覺上皮，一致向基底段的Corti器遷移，而遠離蝸尖段的Corti器。
　　7）與內(nèi)側(cè)的Corti器有連接的LNSR新生感覺上皮，能夠產(chǎn)生向內(nèi)的匯聚運動和向Corti器的整合，而與內(nèi)側(cè)的Corti器無細胞連接的LNSR感染的上皮，可以產(chǎn)生新的毛細胞，但是不能發(fā)生任何群體遷移及變窄的過程。
　　結(jié)論：1）GER和LNSR的非感覺上皮細胞均可作

9、為新生毛細胞的來源。
　　2）新生毛細胞的靜纖毛有序排列，依賴于靜纖毛間側(cè)連接的機械牽拉和動態(tài)重塑。
　　3）受感染過表達math1的細胞一部分轉(zhuǎn)變?yōu)樾旅毎?，一部分轉(zhuǎn)變?yōu)樾轮С旨毎?，這與發(fā)育過程支持細胞和毛細胞具共同的表達math1的前體細胞相似;
　　4）細胞最終分化命運的選擇，與相鄰細胞間的相互作用有關(guān)，可能與math1的表達先后及表達量多少有關(guān)。
　　5）新生的感覺細胞群體能夠向內(nèi)遷移，整合到Corti器