小鼠ESCs在體外向PGCLCs定向誘導及其在體內的卵巢再生研究.pdf

1、生殖系細胞的發(fā)生是目前生命科學研究的熱點課題，但是在哺乳動物中，生殖細胞發(fā)生、特化的具體時間和位置仍然是發(fā)育生物學界一直研究的難點。胚胎干細胞(ESCs)是全能性干細胞，已經證明胚胎干細胞具有在體內和體外向三個胚層分化及形成生殖嵌合體的能力，因此推測ESCs具有分化成卵母細胞的可能性。原生殖細胞來源于胚胎上胚層(epiblast)，是哺乳動物各級生殖細胞的祖細胞?，F(xiàn)已證明在體外可以將ESCs誘導為原生殖樣細胞(PGCLCs)，然后再誘導

2、成為具有受精能力的精子。但是，目前還沒有通過干細胞體外誘導與體內卵巢再生結合的方法誘導獲得卵子的報道。
　　本研究以Oct4-GFP小鼠的ESCs為基本實驗材料，同時將mCherry基因轉入ESCs作為干細胞跟蹤標記。首先利用小分子化合物ActivinA、bFGF、BMP4、BMP8a、SCF和EGF在體外誘導小鼠ESCs向上胚層樣細胞(EpiLCs)、原始生殖樣細胞(PGCLCs)定向分化，然后將帶有紅色熒光標記的ESCs、Ep

3、iLCs、PGCLCs分別與12.5d雌性小鼠生殖腺細胞聚合兩天后移植到經十二烷基硫酸鈉(SDS)處理后的卵巢ECM框架，進而移植到去卵巢的正常小鼠卵巢包膜內，探討三種細胞對卵巢再生的影響。結果:(1)利用AP染色、免疫熒光染色、RT-PCR、q-PCR等實驗方法證明ESCs在向EpiLCs、PGCLCs的誘導過程中，在形態(tài)上、基因水平和蛋白質水平上三種細胞分別符合ESCs、EpiSCs、PGCs的相應形態(tài)、相應基因表達、相應蛋白質表達

4、，說明ESCs在誘導過程中不僅維持了細胞的干細胞特異性，而且得到的ESCs、EpiLCs、PGCLCs是下一步實驗所理想的細胞材料。(2)12.5d雌性小鼠生殖腺細胞單獨，及其分別與ESCs、EpiLCs、PGCLCs三種細胞組合進行的卵巢再生實驗中，卵巢樣組織回收率分別為:67％(16/24)、75％(18/24)、0％(0/24)、100％(24/24)，PGCLCs組卵巢樣組織回收率最高。(3)在由ESCs和PGCLCs與12.5

5、d雌性小鼠生殖腺細胞組合形成的卵巢再生實驗中，均可觀察到正常卵巢結構并檢測到表達紅色熒光的供體細胞，表明ESCs和PGCLCs移植到體內后參與或促進了卵巢的再生;類似的，在EpiLCs與12.5d雌性小鼠生殖腺細胞組合形成的非卵巢結構移植體中也檢測到了表達紅色熒光的標記細胞，但是目前并沒有觀察到正常的卵巢結構，我們推測EpiLCs對于卵巢再生具有一定的抑制作用。終上所述，本研究所用的ESCs在體外條件下可以定向誘導形成EpiLCs和PG