利用小鼠生理性卵巢衰老模型研究缺氧誘導(dǎo)因子-1α在卵巢衰老過程中作用.pdf

1、利用生理性小鼠卵巢衰老模型研究缺氧誘導(dǎo)因子-1α在卵巢衰老過程中作用
　　背景與目的:
　　隨著我國經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展目前我國人口結(jié)構(gòu)正逐漸步入老齡化社會(huì),在生命科學(xué)領(lǐng)域針對衰老本質(zhì)及如何抵御衰老的研究日益受到研究者的重視。由于卵巢的衰老可導(dǎo)致其內(nèi)分泌功能衰退繼而可引發(fā)嚴(yán)重的圍絕經(jīng)期癥狀和諸多年齡相關(guān)疾病。這些都嚴(yán)重影響女性健康及生活質(zhì)量,給家庭社會(huì)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。故研究卵巢衰老確切機(jī)制并研究出有效延緩卵巢衰老靶點(diǎn)成為當(dāng)務(wù)之急。

2、由于卵巢衰老調(diào)控機(jī)制復(fù)雜過程漫長涉及卵泡數(shù)量質(zhì)量雙重下降,因此我們聯(lián)合連續(xù)排卵和臭氧吸入兩種造模方法建立一種新的能夠模擬生理性卵巢衰老的小鼠模型。利用年齡及生殖內(nèi)分泌相關(guān)指標(biāo)對造模效應(yīng)進(jìn)行評估。隨后我們分別檢測了缺氧誘導(dǎo)因子-1在卵泡不同發(fā)育階段,小鼠不同周齡以及在造模不同處理組中表達(dá)。并分析缺氧誘導(dǎo)因子-1在卵泡發(fā)育,卵巢衰老過程中的作用。
　　方法：
　　聯(lián)合連續(xù)序貫腹腔注射孕馬血清,人絨毛膜促性腺激素,前列腺素 F2α

3、產(chǎn)生連續(xù)超數(shù)排卵結(jié)合臭氧吸入構(gòu)建生理性小鼠卵巢衰老模型;隨后采用免疫組織化學(xué)方法、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測靶基因的表達(dá)定位及豐度。應(yīng)用卵泡計(jì)數(shù)分析卵巢內(nèi)各級(jí)卵泡比例。電鏡下觀察細(xì)胞整體大小,形態(tài)及細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)變化。酶聯(lián)免疫吸附測定實(shí)驗(yàn)檢測激素表達(dá)水平改變。產(chǎn)仔試驗(yàn)檢測造模方法對小鼠生育力影響。利用以上方法綜合評價(jià)生理性小鼠卵巢衰老模型效果。隨后采用免疫組織化學(xué)方法檢測缺氧誘導(dǎo)因子-1在卵泡不同發(fā)育階段,不同周齡竇狀卵泡以及在造模不同處

4、理組中竇狀卵泡表達(dá)探討缺氧誘導(dǎo)因子-1在卵泡發(fā)育和卵巢衰老過程中的作用。
　　結(jié)果：
　　(1)10次連續(xù)超數(shù)排卵可以明顯降低卵巢中AMH表達(dá)以及始基卵泡比例。超微結(jié)構(gòu)顯示顆粒細(xì)胞中脂滴明顯減少,進(jìn)而造成雌孕激素分泌下降,產(chǎn)仔總數(shù)下降,產(chǎn)仔間隔時(shí)間延長。
　　(2)臭氧吸入可以明顯升高卵巢內(nèi) SOD2,CAT表達(dá)以及氧化產(chǎn)物含量。超微結(jié)構(gòu)顯示顆粒細(xì)胞中線粒體損傷形態(tài)改變。產(chǎn)仔總數(shù)下降,產(chǎn)仔間隔時(shí)間延長。
　　(3

5、)兩者聯(lián)合效應(yīng)疊加。
　　(4) HIF-1α在卵泡中卵母及顆粒細(xì)胞均有特異性表達(dá),其表達(dá)水平隨卵泡的發(fā)育而升高,竇狀卵泡中表達(dá)水平最高。
　　(5) HIF-1α,VEGF在竇狀卵泡中表達(dá)水平隨小鼠增齡而升高。
　　(6) HIF-1α在生理性卵巢衰老模型各處理組竇狀卵泡中均有明顯升高。
　　(7) Egr-1、Gadd45α蛋白在不同發(fā)育階段卵泡的卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞中均有表達(dá),表達(dá)隨卵泡發(fā)育而增強(qiáng)。
　

6、　結(jié)論：
　　(1)10次連續(xù)超數(shù)排卵可以明顯降低卵巢中始基卵泡數(shù)量。
　　(2)臭氧吸入可以明顯升高卵巢內(nèi)氧化應(yīng)激壓力。
　　(3)聯(lián)合連續(xù)排卵和臭氧吸入成功構(gòu)建生理性小鼠卵巢衰老模型。
　　(4) HIF-1α可能通過調(diào)節(jié)卵泡中血管發(fā)育參與卵泡發(fā)育過程。
　　(5)增齡過程中卵巢中竇狀卵泡缺氧程度增加。
　　(6)連續(xù)超數(shù)排卵和氧化應(yīng)激壓力升高均會(huì)引起卵巢內(nèi) HIF-1α表達(dá)增高。
　　(7

7、) Egr-1、Gadd45α在卵泡的生長發(fā)育及閉鎖過程中可能起重要調(diào)控作用。
　　一種新的生理性小鼠卵巢衰老模型構(gòu)建及評價(jià)
　　生理性卵巢衰老是一個(gè)伴隨卵泡數(shù)量和質(zhì)量共同下降的長期復(fù)雜過程。但是目前并沒有一種合適的動(dòng)物模型能夠模擬此過程。目前有研究表明連續(xù)超排可能減少始基卵泡池;氧化應(yīng)激壓力同樣在卵巢衰老過程中發(fā)揮重要作用。為了驗(yàn)證這兩種假說,我們利用小鼠序貫腹腔注射孕馬血清,人絨毛膜促性腺激素,前列腺素 F2α結(jié)合臭氧吸

8、入成功地造成了小鼠卵巢始基卵泡池縮小以及氧化損傷。連續(xù)超排造成卵巢中始基卵泡比例下降,抗苗勒氏管激素 mRNA表達(dá)及血清雌孕激素含量下降。臭氧吸入導(dǎo)致卵巢中超氧化物歧化酶2,過氧化氫酶 mRNA表達(dá)上升,同時(shí)氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷,4-羥基壬烯酸和硝基酪氨酸含量上升。細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)分析表明:連續(xù)超排造成卵泡顆粒細(xì)胞中脂滴含量明顯減少,臭氧吸入導(dǎo)致顆粒細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)膜結(jié)構(gòu)破壞。正是這些超微結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致卵泡功能下降進(jìn)而引起連續(xù)超排組,臭

9、氧吸入組和造模組小鼠生育力明顯下降。這些結(jié)果共同說明連續(xù)超排結(jié)合臭氧吸入的造模方法可以模擬生理性卵巢衰老過程中由始基卵泡池縮小和氧化損傷增加造成的一系列生殖內(nèi)分泌改變。
　　小鼠卵泡不同發(fā)育期缺氧誘導(dǎo)因子-1α蛋白的表達(dá)及其意義
　　目的：觀察缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)在卵泡不同發(fā)育期中的表達(dá),初步探討其與卵泡發(fā)育的關(guān)系。方法：選擇不同周齡的C57BL/6J小鼠卵巢,用免疫組化法檢測卵泡不同發(fā)育期中HIF-1α蛋白。

10、結(jié)果：在小鼠各級(jí)卵泡的卵母及顆粒細(xì)胞中均有HIF-1α蛋白表達(dá),且其表達(dá)豐度隨卵泡發(fā)育而增強(qiáng)。HIF-1α蛋白在不同階段卵泡中卵母顆粒細(xì)胞中表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.05)。結(jié)論：小鼠卵泡發(fā)育所有階段HIF-1α均有表達(dá),且在卵泡發(fā)育后期強(qiáng)表達(dá)。提示HIF-1α在卵泡生長發(fā)育過程中可能起重要作用。
　　小鼠竇狀卵泡缺氧誘導(dǎo)因子-1α、血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達(dá)的增齡變化及其意義
　　目的：探討缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF

11、-1α)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在小鼠不同周齡竇狀卵泡的表達(dá)及其意義。方法:選擇不同周齡的C57BL/6J小鼠卵巢,用免疫組化法檢測不同發(fā)育期卵泡中HIF-1α、VEGF蛋白。結(jié)果：HIF-1α、VEGF蛋白在不同周齡階段竇狀卵泡的卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞中均有表達(dá),表達(dá)隨周齡增長而增強(qiáng)。且不同周齡階段竇狀卵泡中顆粒細(xì)胞中HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.05)。同時(shí)HIF-1α、VEGF在各級(jí)顆粒細(xì)胞的表達(dá)具

12、有較強(qiáng)的相關(guān)性(rs=0.786, P<0.05)。結(jié)論：小鼠竇狀卵泡HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)且隨周齡的增長而上升,提示HIF-1α、VEGF可能在卵巢衰老過程中發(fā)揮重要作用。
　　利用竇狀卵泡中缺氧誘導(dǎo)因子-1α蛋白表達(dá)評價(jià)小鼠生理性卵巢衰老模型
　　目的：觀察缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)在生理性卵巢衰老模型中的表達(dá),初步探討其與造模處理方法的關(guān)系。方法：選擇不同組別的C57BL/6J小鼠卵巢,用免疫組化法檢測

13、卵泡不同發(fā)育期中HIF-1α蛋白。結(jié)果：HIF-1α蛋白在不同組別卵泡卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞中均有表達(dá),且連續(xù)超排組,臭氧接觸組,以及造模組小鼠中HIF-1α蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.05)。結(jié)論：卵泡發(fā)育不同階段HIF-1α均有表達(dá),在卵泡發(fā)育后期強(qiáng)表達(dá)。提示HIF-1α在卵泡的生長發(fā)育可能起重要調(diào)控作用。
　　小鼠卵泡不同發(fā)育階段Egr-1、Gadd45α蛋白的表達(dá)及其相互關(guān)系
　　目的:探討Egr-1、Gadd

14、45α在小鼠卵泡不同階段的表達(dá)及其相互關(guān)系。方法:選擇不同發(fā)育時(shí)期的昆明小鼠卵巢,用免疫組化法檢測不同發(fā)育期卵泡中Egr-1、 Gadd45α蛋白。結(jié)果: Egr-1、Gadd45α蛋白在不同發(fā)育階段卵泡的卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞中均有表達(dá),表達(dá)隨卵泡發(fā)育而增強(qiáng)。且不同發(fā)育階段卵泡中卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞中Egr-1、Gadd45α蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.05)。閉鎖卵泡Egr-1、Gadd45α蛋白表達(dá)強(qiáng)烈,其表達(dá)強(qiáng)度明顯高于各級(jí)