卵巢生殖干細(xì)胞中Notch信號(hào)通路與卵巢衰老的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　通過檢測(cè) Notch信號(hào)通路在卵巢生殖干細(xì)胞及在生理性和病理性衰老小鼠卵巢表面上皮（Ovarian surface epithelium, OSE）中的表達(dá)及動(dòng)態(tài)變化，探索Notch通路對(duì)卵巢生殖干細(xì)胞增殖分化的調(diào)控作用，為哺乳動(dòng)物卵巢生殖干細(xì)胞的體內(nèi)調(diào)控機(jī)制提供了新的研究方向，給卵巢生殖干細(xì)胞在女性不孕癥中的臨床治療帶來更多可能。
　　方法：
　　1、用原代培養(yǎng)技術(shù)取3-5D乳鼠的卵巢生殖干細(xì)胞，以STO

2、細(xì)胞為飼養(yǎng)層，以MEM-α為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，將卵巢生殖干細(xì)胞置于37℃、5％CO2的環(huán)境中培養(yǎng)；
　　2、以20M小鼠作為生理性衰老小鼠，以環(huán)磷酰胺/白消安聯(lián)合制劑行腹腔注射構(gòu)建的不孕小鼠模型作為病理性衰老小鼠。病理性衰老小鼠給予體外轉(zhuǎn)染慢病毒（Notch1 intracellular domain, NICD）高表達(dá)載體，以激活Notch信號(hào)通路。
　　3、采用HE染色法檢測(cè)2M、不孕模型、20M及不孕模型注射慢病毒NICD高

3、表達(dá)載體后小鼠卵巢中卵泡發(fā)育的變化；
　　4、采用免疫組織化學(xué)方法同步檢測(cè)上述小鼠OSE中生殖細(xì)胞和干細(xì)胞標(biāo)記物MVH、Oct4以及Notch信號(hào)通路相關(guān)基因Notch1、Hes1的表達(dá)變化；
　　5、采用免疫熒光雙標(biāo)組織化學(xué)法檢測(cè)上述小鼠 OSE中 MVH/Oct4、MVH/Notch1、MVH/Hes1的共表達(dá)變化；
　　6、采用Western Blot法檢測(cè)上述小鼠OSE中MVH、Oct4、Notch1、Hes1

4、等的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1、免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)到卵巢生殖干細(xì)胞中存在生殖細(xì)胞標(biāo)記物MVH和干細(xì)胞標(biāo)記物Oct4的共表達(dá)，以及MVH和Notch信號(hào)通路受體Notch1、靶分子Hes1的共表達(dá)；
　　2、HE染色可見2M正常小鼠卵巢中存在豐富的發(fā)育中卵泡，而不孕模型及20M小鼠卵巢中卵泡數(shù)量大大減少甚至消失；不孕模型小鼠經(jīng)體外注射慢病毒NICD高表達(dá)載體后卵巢中的卵泡數(shù)量則有所增加；
　　3、免疫組化法檢測(cè)

5、結(jié)果顯示2M正常小鼠卵巢皮層中生殖細(xì)胞和干細(xì)胞標(biāo)記物（MVH、Oct4）以及Notch信號(hào)通路相關(guān)基因(Notch1、Hes1)的表達(dá)量較高，而不孕及衰老小鼠卵巢皮層中MVH、Oct4、Notch1、Hes1的表達(dá)量均明顯下降，體外注射慢病毒 NICD高表達(dá)載體后的小鼠卵巢皮層中上述基因的表達(dá)量均有所上升；
　　4、免疫熒光雙標(biāo)組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示2M正常小鼠卵巢皮層中MVH/Oct4、MVH/Notch1、MVH/Hes1存在

6、共表達(dá)且表達(dá)量高，而衰老及不孕小鼠卵巢皮層中MVH與Oct4、Notch1、Hes1的共表達(dá)明顯下降，體外注射慢病毒NICD高表達(dá)載體后上述基因的表達(dá)量均有所上升；
　　5、WB檢測(cè)結(jié)果可見，2M正常小鼠卵巢中MVH、Oct4、Notch1、Hes1的表達(dá)量明顯高于衰老及不孕小鼠，而體外注射慢病毒NICD高表達(dá)載體后小鼠卵巢中上述基因的表達(dá)量均明顯增高。
　　結(jié)論：
　　1、小鼠卵巢生殖干細(xì)胞和OSE中存在生殖細(xì)胞和干