人骨髓來源的多能成體祖細(xì)胞在體外定向誘導(dǎo)分化為肝樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:人骨髓來源的多能成體祖細(xì)胞分離純化及體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究 目的:建立體外分選純化人MAPCs的方法,用自行配制的細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)MAPCs進(jìn)行體外培養(yǎng),了解其生長(zhǎng)、增殖特性.方法:取志愿者適量骨髓后采用梯度密度離心法分離獲取單個(gè)核細(xì)胞,對(duì)單個(gè)核細(xì)胞行貼壁培養(yǎng)后,將獲取的骨髓貼壁細(xì)胞通過CD45、GlyA免疫微磁珠負(fù)分選,流式細(xì)胞儀鑒定分選后細(xì)胞純度;培養(yǎng)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,對(duì)傳代到不同階段的細(xì)胞進(jìn)行CD45、GlyA流式細(xì)胞分析,初步

2、了解MAPCs在培養(yǎng)、增殖過程中的免疫學(xué)穩(wěn)定性.結(jié)論:(1)CD45、GlyA免疫微磁珠負(fù)分選可從骨髓中分離高純度的MAPCs;(2)MAPCs在體外有較強(qiáng)的增殖能力,且能保持較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定狀態(tài);(3)我們自行研制的人MAPCs培養(yǎng)基能成功體外培養(yǎng)MAPCs.第二部分:人骨髓來源的多能成體祖細(xì)胞在不同誘導(dǎo)條件下向肝樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究 目的:探索人骨髓來源MAPCs在不同條件下誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的可行性;摸索并確立骨髓MAPCs誘導(dǎo)為肝細(xì)

3、胞的適當(dāng)培養(yǎng)方法及條件,建立一個(gè)獲得"骨髓源MAPCs"的成熟技術(shù)平臺(tái),為其在組織工程學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ).方法:(1)分組:A組:HGF(20ng/ml)、B組:FGF-4(10ng/ml)、C組:HGF(20ng/ml)+FGF-4(10ng/ml)、D組:24小時(shí)70％肝葉切除兔門靜脈血清(RPVS,10%濃度)誘導(dǎo)分化MAPCs,E組(陽性對(duì)照組):L-02人肝細(xì)胞株、F組(陰性對(duì)照組):未加任何誘導(dǎo)因素的MAP

4、Cs;(2)免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光化學(xué)鑒定各組不同誘導(dǎo)分化階段細(xì)胞的ALB、AFP、CK-18、CK-19等肝細(xì)胞特征的表型變化并計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞比率;(3)RT-PCR檢測(cè)A、B、C組不同誘導(dǎo)分化階段細(xì)胞的ALB、AFP、CK-18、CK-19的mRNA轉(zhuǎn)錄;(4)Western blot檢測(cè)B、C組誘導(dǎo)分化第21天、35天后細(xì)胞的ALB的表達(dá).結(jié)論:(1)人骨髓來源的MAPCs具有向肝樣細(xì)胞分化的潛能;(2)HGF及FGF-4具有誘導(dǎo)人