骨髓源性多能成體祖細(xì)胞向起搏細(xì)胞的誘導(dǎo)分化.pdf

1、生物心臟起搏器是心血管領(lǐng)域研究熱點(diǎn)問題。當(dāng)前構(gòu)建生物心臟起搏器主要包括基因轉(zhuǎn)染、細(xì)胞移植和組織工程化起搏、傳導(dǎo)組織移植三種方法?；蜣D(zhuǎn)染普遍存在外源基因在體內(nèi)缺乏長期穩(wěn)定表達(dá)、難以有效調(diào)控等缺點(diǎn)。細(xì)胞移植，組織工程化起搏、傳導(dǎo)組織移植可以避免通過轉(zhuǎn)染基因建立生物起搏器的缺點(diǎn)。但是，目前在心臟生物起搏器研究中探討的組織細(xì)胞(竇房結(jié)細(xì)胞、幼稚心肌細(xì)胞、基因轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞等)、胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞，均有其目前無法克服的弊端，尋找新的種子細(xì)

2、胞，是心臟生物起搏器研究的當(dāng)務(wù)之急。本研究擬采用條件培養(yǎng)、與起搏細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)等方法，探討將骨髓多能成體祖細(xì)胞誘導(dǎo)分化為起搏細(xì)胞的可能性，旨在為心臟生物起搏器的構(gòu)建提供一種來源豐富、無排斥反應(yīng)、活性好的種子細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，5-氮雜胞苷+內(nèi)皮素-1、竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)液等條件培養(yǎng)可使MAPCs表達(dá)起搏離子通道，與竇房結(jié)細(xì)胞共培養(yǎng)能將MAPCs誘導(dǎo)分化為起搏樣細(xì)胞；該細(xì)胞體外具有驅(qū)動(dòng)心肌跳動(dòng)的起搏活性。
　　 研究目的：
　　 病

3、態(tài)竇房結(jié)綜合癥、房室傳導(dǎo)阻滯等緩慢型心率失常嚴(yán)重威脅人類健康，而電子起搏器存在諸多問題，制約了它的應(yīng)用。生物心臟起搏理論上可以克服電子起搏器的缺陷，有很好的臨床應(yīng)用前景。
　　 當(dāng)前構(gòu)建生物心臟起搏器主要包括基因轉(zhuǎn)染、細(xì)胞移植和組織工程化竇房結(jié)、房室結(jié)、傳導(dǎo)束移植三種方法。基因轉(zhuǎn)染普遍存在外源基因在體內(nèi)缺乏長期穩(wěn)定表達(dá)、難以有效調(diào)控；缺乏高效、安全、導(dǎo)向性好的載體系統(tǒng)等缺點(diǎn)。細(xì)胞移植建立心臟生物起搏器可以避免應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染方法建立

4、生物起搏器的缺點(diǎn)，而組織工程化竇房結(jié)、房室結(jié)、傳導(dǎo)束的構(gòu)建將心臟生物起搏器的研究提高到組織、器官水平。然而，目前在心臟生物起搏器研究中涉及細(xì)胞包括：組織細(xì)胞(竇房結(jié)細(xì)胞、幼稚心肌細(xì)胞、基因轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞等)，存在著對移植部位微環(huán)境適應(yīng)能力差及供體來源困難等問題；胚胎干細(xì)胞，有報(bào)道表明胚胎干細(xì)胞分化的自發(fā)跳動(dòng)的心肌細(xì)胞移植到心臟后可以發(fā)揮起搏功能，并對神經(jīng)性調(diào)節(jié)有反應(yīng)，但是胚胎干細(xì)胞具有向終末細(xì)胞分化的特性，而分化的終末細(xì)胞則失去起搏特性

5、，精確控制其分化方向尚難解決，以及免疫排斥反應(yīng)問題；間充質(zhì)干細(xì)胞，雖然在體外能夠?qū)㈤g充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為具有起搏電流的細(xì)胞，但間充質(zhì)干細(xì)胞并沒有特異的起搏離子通道，單一的起搏電流(If)能否持久維持起搏功能，尚缺乏實(shí)驗(yàn)依據(jù)，因此，一般認(rèn)為，間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)來的具有起搏功能的細(xì)胞在體內(nèi)并不能替代起搏細(xì)胞，僅作為攜帶起搏基因的載體?？梢?，尋找新的種子細(xì)胞，是心臟生物起搏器研究的當(dāng)務(wù)之急。
　　 骨髓源性多能成體祖細(xì)胞(multipo

6、tent adult progenitor cells，MAPCs)，可來源自體、取材方便、活性好、分化增殖能力強(qiáng)，如能誘導(dǎo)分化為起搏細(xì)胞則可以將心臟生物起搏器的研究推進(jìn)到可臨床應(yīng)用的層面，然而，目前尚無MAPCs向起搏細(xì)胞誘導(dǎo)分化的報(bào)道。
　　 本研究擬采用條件培養(yǎng)、與起搏細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)等方法，探討將MAPCs誘導(dǎo)分化為起搏細(xì)胞的可能性，旨在為心臟生物起搏器的構(gòu)建提供一種來源豐富、無排斥反應(yīng)、活性好的種子細(xì)胞。
　　 第

7、一部分MAPCs的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 研究目的:進(jìn)行MAPCs的分離、培養(yǎng)和鑒定，獲取可用于向起搏細(xì)胞誘導(dǎo)分化的種子細(xì)胞。
　　 材料與方法:全骨髓培養(yǎng)法、MAPCs專用培養(yǎng)基培養(yǎng)1月齡大鼠脛骨和股骨骨髓。培養(yǎng)1個(gè)月后，經(jīng)免疫磁珠法分選CD45陰性細(xì)胞，克隆培養(yǎng)并擴(kuò)增。經(jīng)鼠SSEA-1多克隆抗體流式細(xì)胞檢測陽性細(xì)胞百分比，Oct-4、SSEA-4、CD44、CD45、CD133、MHCⅡ免疫熒光檢測細(xì)胞表面標(biāo)志，并經(jīng)

8、Western Blot分析Oct-4蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:培養(yǎng)的MAPCs細(xì)胞呈長梭形，細(xì)胞潛伏期短，24h后已經(jīng)開始增殖，倍增時(shí)間為2d。蛋白表達(dá)Oct-4+、SSEA-4+、CD44-、CD45-、CD133-、MHCⅡ-，流式細(xì)胞技術(shù)檢測SSEA-1陽性細(xì)胞為86.41％。
　　 結(jié)論:成功分離培養(yǎng)了MAPCs。
　　 第二部分條件培養(yǎng)基對MAPCs的誘導(dǎo)分化
　　 研究目的:分別采用5-氮雜

9、胞苷+內(nèi)皮素-1、竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)MAPCs，探討條件培養(yǎng)基將MAPCs誘導(dǎo)分化為起搏細(xì)胞的可能性。
　　 材料與方法:分別用10mmol/L的5-氮雜胞苷結(jié)合10-8M的內(nèi)皮素-1和竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)后的培養(yǎng)液誘導(dǎo)5～10代MAPCs。免疫熒光檢測α-SMA、mlv2α、HCN2、HCN4蛋白表達(dá)；real-time PCR檢測HCN1、HCN2、HCN4等基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果:5-氮胞苷與ET-1聯(lián)合使用的方法誘

10、導(dǎo)MAPCs，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞變大，多數(shù)呈大三角形。誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA、mlv2α，編碼起搏電流If的HCN2、HCN4，多能性干細(xì)胞標(biāo)志物Oct-4和SSEA-4不再表達(dá)。竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)MAPCs后細(xì)胞同樣變大，但突起較少，基本還保持長梭形；竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)后的細(xì)胞HCN2、HCN4免疫熒光染色表達(dá)陽性，而Connexin43和TnT則基本不表達(dá)；real-time PCR檢測HCN2、HCN4

11、、Cav1.2、ERG、KvLQT1、MiRP1基因表達(dá)，但是遠(yuǎn)低于培養(yǎng)的竇房結(jié)中的表達(dá)水平。
　　 結(jié)論:條件培養(yǎng)不能將MAPCs誘導(dǎo)分化為典型的起搏細(xì)胞，但具備起搏離子通道。
　　 第三部分竇房結(jié)細(xì)胞共培養(yǎng)對MAPCs的誘導(dǎo)分化
　　 研究目的:通過MAPCs與竇房結(jié)細(xì)胞共培養(yǎng)的研究，探討共培養(yǎng)將MAPCs誘導(dǎo)分化為起搏細(xì)胞的可能性。
　　 材料與方法:首先將差速貼壁結(jié)合BrdU培養(yǎng)的新生大鼠竇房結(jié)細(xì)

12、胞接種于6孔板上，然后將MAPCs第5代細(xì)胞加入Transwell小室，密度為每孔1×104個(gè)細(xì)胞。將種植細(xì)胞的Transwell小室插入6孔板中，在37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在共培養(yǎng)1周、2周、3周和4周后，免疫熒光化學(xué)、real-time PCR檢測相關(guān)分子的表達(dá)。
　　 結(jié)果:共培養(yǎng)后，與條件培養(yǎng)類似，細(xì)胞變大，但突起較少，基本還保持長梭形。相關(guān)標(biāo)志物HCN4、Connexin40和Connexin45免疫熒光染色

13、表達(dá)陽性，HCN2表達(dá)弱，而Connexin43和TnT則基本不表達(dá)；real-time PCR檢測HCN2、HCN4、Cav1.2、ERG、KvLQT1、MiRP1基因表達(dá)，表達(dá)高于條件培養(yǎng)組而低于培養(yǎng)的竇房結(jié)。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長mRNA略有增加，但3周后就基本達(dá)平臺(tái)期。Cav3.1、Kir2.1基因的表達(dá)少或基本不表達(dá)。
　　 結(jié)論:與竇房結(jié)細(xì)胞共培養(yǎng)不能將MAPCs誘導(dǎo)分化為典型的具有自發(fā)搏動(dòng)活性的起搏細(xì)胞，但與條件培養(yǎng)基誘

14、導(dǎo)分化相比，更接近起搏細(xì)胞，我們暫稱之為起搏樣細(xì)胞。
　　 第四部分起搏樣細(xì)胞起搏功能的體外檢測
　　 研究目的:將與竇房結(jié)細(xì)胞共培養(yǎng)2周獲得的起搏樣細(xì)胞，種植在靜息的新生大鼠心肌細(xì)胞單層上，觀察細(xì)胞搏動(dòng)情況，探討該細(xì)胞對心肌的起搏作用。
　　 材料與方法:將與竇房結(jié)細(xì)胞共培養(yǎng)2周獲得的起搏樣細(xì)胞，種植于靜息的新生大鼠心肌單層上，觀察細(xì)胞搏動(dòng)情況。分別加入1×10-7mol/1異丙腎上腺素和先加入1×10-6mo