毛乳頭體內再生誘導模型的建立.pdf

1、目的：
　　1、建立單個大鼠觸須毛囊上段裸鼠皮下移植方法，利用大鼠觸須毛囊培養(yǎng)液作為促進毛乳頭（dermal papilla，DP）再生的誘導來源，建立DP體內再生誘導模型；
　　2、追蹤DP再生的完整過程，觀察毛囊培養(yǎng)液對DP再生率的影響；
　　3、追蹤模型中新生DP的細胞來源；
　　4、選取與毛囊真皮成分發(fā)生密切相關的Wnt5a信號分子：①追蹤wnt5a在DP再生過程中的時空表達；②觀察wnt5a在大鼠DP胚

2、胎發(fā)生前后的表達模式；②對比DP體內誘導模型與大鼠DP胚胎發(fā)生過程Wnt5a的表達模式，初步探討DP再生機制。
　　方法：
　　1、DP體內再生誘導模型制作
　?、俅笫笥|須毛囊上段移植體的制作和鑒定：用顯微器械肉眼分離得到SD大鼠觸須毛囊，以鑷子輕輕夾住毛囊上端并擠壓，暴露毛囊下端紅色的含毛乳頭的毛球部，鏡下緊貼毛球部上方用新剃須刀片將其橫向裁切，得到大鼠觸須毛囊上段標本。隨機抽取大鼠觸須毛囊上段標本和切除的毛球部，掃

3、描電鏡觀察是否完整切除毛球部。
　?、诿遗囵B(yǎng)液的應用：取大鼠觸須毛囊上段標本時，挑選出移植用的生長期毛囊，其余毛囊（100-140個），加入含10％血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液。第2、4、6、8天換液時留取舊液用滅酶的小管保存，1h內裸鼠注射，注射于裸鼠毛囊移植點皮下，0.1ml/移植點。
　　③單個大鼠觸須毛囊上段裸鼠皮下移植：
　　實驗組：毛囊上段移植體用毛囊移植筆以30-45度角注射于裸鼠皮下，每個毛囊距離

4、1-1.5cm，背部左右兩側各三個。移植后第2，4，6，8天分別注射毛囊培養(yǎng)液；
　　對照組：移植方法同實驗組，但移植后第2，4，6，8天分別注射含10%血清的DMEM培養(yǎng)液。移植后定期拍照、取材、制作石蠟切片，觀察形態(tài)學變化。
　　2、新生DPC來源追蹤
　　①分組：毛囊上段BrdU浸泡標記組：大鼠觸須毛囊用含5μmol/L BrdU的10%血清DMEM培養(yǎng)基浸泡4小時后再切除毛球部，裸鼠皮下移植；
　　大鼠B

5、rdU標記組：每隔2小時對大鼠腹腔注射5mg/kg的BrdU，連續(xù)注射4次后處死大鼠，取觸須毛囊，切除毛球部后進行裸鼠皮下移植；
　　BrdU裸鼠注射標記組：正常大鼠毛囊切除毛乳頭后進行裸鼠皮下移植，取材前2h裸鼠腹腔注射5mg/kg的BrdU，2h后處死取材。
　?、诙ㄆ谌〔?，制作石蠟標本并切片，熒光免疫組化追蹤BrdU的表達情況。
　　3、Wnt5a在大鼠毛囊胚胎發(fā)生和大鼠觸須毛囊上段裸鼠移植誘導DP再生模型中表達

6、的對比
　?、贌晒饷庖呓M化法觀察wnt5a在大鼠觸須毛囊上段裸鼠移植誘導DP再生過程的時空表達情況。
　　②大鼠DP胚胎發(fā)生過程Wnt5a的表達模式：分別取E12.5、E13.5、E14.5、E15.5胎齡的大鼠胚胎，固定、制作蠟塊、切片，HE染色觀察表皮和真皮形態(tài)變化，免疫組化觀察wnt5a表達情況及時間變化趨勢。
　?、蹖Ρ?DP體內誘導模型與大鼠 DP胚胎發(fā)生過程 Wnt5a的表達模式，初步探討DP再生機制。

7、r>　　結果：
　　1、DP再生模型制作
　?、俅笫笥|須毛囊上段切除效果鑒定：電鏡掃描結果顯示，毛囊切面光滑，切除方法效果良好，外層有結締組織鞘包裹整個毛囊結構，內部可見外根鞘包裹毛根，未見毛乳頭。由于毛乳頭部位無毛根，因此可以確定毛乳頭已被完全切除。
　　② DP再生誘導模型形成過程觀察：移植術后的裸鼠背部可見移植點距離均一，傷口微小，流血少，傷口恢復迅速。至第3天移植部位周圍皮膚長出細密毛發(fā)。第22天在其中一個移植

8、點觀察到一根觸須樣的毛發(fā)纖維。大鼠處死后觀察：移植的毛囊上段沒有移位。移植的毛囊上段已向下生長形成完整的毛球部，毛球部形態(tài)與觸須毛囊相似。毛囊周圍血供豐富，毛囊上段可見一條類似毛球部血供的紅色線狀結構，輕輕擠壓此結構，可見毛囊下端突出于紅色的含新生毛乳頭的毛球部。
　　HE染色觀察：對照組和實驗組大鼠在毛囊斷端都有新生的結締組織包裹形成鞘狀，但對照組大鼠毛囊形成的結締組織鞘形狀不規(guī)則，在毛囊斷端形成明顯凹陷，新生成的結締組織鞘內有

9、血供形成，但細胞數稀少，沒有形成毛乳頭。實驗組大鼠觸須毛囊上段移植后第3天,毛囊斷端已被結締組織包裹,結締組織鞘已經完整，中部斷端處稍向內凹陷，但切斷痕跡并不明顯，內部有細胞填充，但數量較少。移植后第7天,結締組織鞘增厚，毛乳頭外周開始形成，內有血管，毛乳頭外周也有大量細胞聚集，血供豐富。移植后第9天,結締組織鞘明顯增厚，內部細胞生長速度相對較慢，典型的梨形毛乳頭已經形成，毛囊斷端移植部位周圍有小毛囊正在形成。移植后第3周,大鼠毛囊整體

10、被結締組織鞘包裹，一側可以看到明顯斷端，此處結締組織鞘向外膨出，另一側則不明顯。典型、成熟DP已形成，移植體周圍出現(xiàn)大量脂肪組織，與對照組相比，這些脂肪組織更像是新生成而不是裸鼠本身固有組織。所取實驗組標本除少數毛囊移植體失活外，其余成活毛囊全部重新長成不同生長程度的毛乳頭，DP再生率為88%。
　　2、新生DPC來源觀察
　　實驗組采取了三種不同的BrdU導入方式，通過熒光免疫組化證實，毛囊上段BrdU浸泡標記組的導入效果

11、良好。
　　DP形成部位和毛囊斷端位置結締組織鞘的細胞BrdU呈強陽性表達，毛囊上段頂端細胞呈彌散性陽性表達，提示再生的DP很可能來源于毛囊移植體的結締組織鞘。裸鼠皮膚無陽性細胞表達。
　　3、Wnt5a在大鼠毛囊胚胎發(fā)生和大鼠觸須毛囊上段裸鼠移植誘導 DP再生模型中的表達模式：
　?、賹嶒灲M大鼠觸須毛囊上段移植后第3天，在毛囊上段頂端和毛囊斷端的結締組織鞘Wnt5a呈高表達。移植后第7天，頂端細胞逐漸向下分化形成DP

12、細胞，呈強陽性，毛球部外周 Wnt5a呈陽性表達，毛囊斷端的結締組織鞘 Wnt5a呈高表達。移植后第9天，典型的梨形DP已形成，其中Wnt5a呈強陽性。
　?、?E12.5 Wnt5a在表皮細胞表達；E13.5 Wnt5a在表皮細胞表達，且表達增強；E14.5 Wnt5a表達由表皮轉移至真皮，在真皮細胞漿明顯表達；E15.5 Wnt5a表達在真皮結締組織明顯增強，在表皮的表達消失。
　　結論：
　?、俦狙芯拷⒌膯蝹€大

13、鼠觸須毛囊上段裸鼠移植誘導DP再生的模型，DP體內再生率最高、穩(wěn)定、可重復性高，可以作為研究DP體內再生的良好平臺；
　?、诿乙浦补P的應用使毛囊上段移植部位創(chuàng)傷小，愈合迅速；其次移植的毛囊方向、角度、深度具有高度可控性；并可實現(xiàn)單個毛囊的移植；
　?、勖遗囵B(yǎng)液短期、小量應用即可高效促進毛球部DP的再生；
　?、茉偕腄PC可能來自毛囊移植體的結締組織鞘；
　?、?Wnt5a在DP胚胎發(fā)生前后及本模型DP形成的