紅景天苷減輕心肌缺血-再灌注損傷中蛋白質(zhì)O-GlcNAc變化的意義(附烏拉坦對(duì)離體大鼠心臟保存作用的探討).pdf

1、O-連接N-乙酰氨基葡萄糖基化(O-linked N-acetylglucosamine,O-GlcNAc)是發(fā)生在細(xì)胞漿與細(xì)胞核內(nèi)的、僅單個(gè)N-乙酰氨基葡萄糖通過(guò)O-糖苷鍵連接到絲氨酸或蘇氨酸(Ser/Thr)羥基上、一種廣泛動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾現(xiàn)象，蛋白質(zhì)的O-GlcNAc可以敏銳地感受環(huán)境變化，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)間的相互作用，影響細(xì)胞的信號(hào)級(jí)聯(lián)通路。在多種形式的應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞活化己糖胺生物合成途徑(HBP)，增加蛋白質(zhì)的O-GlcNA

2、c修飾水平，從而提高細(xì)胞存活，減輕細(xì)胞損傷。
　　紅景天苷是從藏藥紅景天分離出來(lái)的一種苯乙醇類化合物，具有抗缺氧、抗腫瘤、抗衰老、抗肝纖維化等作用。在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床資料證實(shí)，紅景天苷具有心肌保護(hù)作用，但對(duì)紅景天苷減輕心肌缺血/再灌注損傷機(jī)制的研究尚不多。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)缺血/再灌注損傷模型和離體心臟灌注缺血/再灌注損傷模型，觀察紅景天苷對(duì)心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用，并通過(guò)與四氧嘧啶（O-連接N-乙酰

3、氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶抑制劑，能夠抑制O-GlcNAc的形成）作用比較，探討O-GlcNAc在這種保護(hù)機(jī)制中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)一紅景天苷對(duì)培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用
　　方法：取1～2d齡SD乳鼠，分離、培養(yǎng)原代乳鼠心肌細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)3d后建立缺血/再灌注損傷模型：用缺氧液置換正常培養(yǎng)液，置入三氣培養(yǎng)箱（95％N2+5％CO2）缺氧培養(yǎng)4h，然后細(xì)胞再置入37℃、21％O2和5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)16h。培養(yǎng)的

4、心肌細(xì)胞分為5組（n=6）：①正常對(duì)照組：用正常培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞；②正常培養(yǎng)+紅景天苷預(yù)處理：紅景天苷80μmol/L預(yù)處理細(xì)胞24h，然后用正常培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞20h；③缺血/再灌注：細(xì)胞正常培養(yǎng)3d后按照缺血/再灌注模型培養(yǎng)；④缺血/再灌注+紅景天苷+四氧嘧啶預(yù)處理：紅景天苷80μmol/L加四氧嘧啶2.5mmol/L預(yù)處理細(xì)胞24h，然后按照缺血/再灌注組培養(yǎng)；⑤缺血/再灌注+紅景天苷預(yù)處理：紅景天苷80μmol/L預(yù)處理細(xì)胞24h，

5、然后按照缺血/再灌注組培養(yǎng)。處理完畢，檢測(cè)各組細(xì)胞存活率、乳酸脫氫酶（LDH）釋放量、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞ATP含量、細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平、葡萄糖攝取率及細(xì)胞O-GlcNAc水平。
　　結(jié)果：與對(duì)照組比較，單純?nèi)毖?再灌注損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞存活率顯著降低為64.7±4.5％，紅景天苷預(yù)處理組心肌細(xì)胞缺血/再灌注后存活率增加至85.8±3.1％，與單純?nèi)毖?再灌注組比較差異顯著；加入四氧嘧啶后心肌細(xì)胞存活率減少為66.5±2.9％，與紅景

6、天苷預(yù)處理組比較差異顯著。缺血/再灌注損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞LDH釋放量從9.3±1.5％增加至38.5±2.1％，紅景天苷預(yù)處理顯著降低心肌細(xì)胞LDH釋放量至21.2±1.7％，與單純?nèi)毖?再灌注組比較差異顯著；加入四氧嘧啶后心肌細(xì)胞LDH釋放量增加至39.3±1.6％，與紅景天苷預(yù)處理組比較差異顯著。缺血/再灌注后心肌細(xì)胞凋亡率從6.5±1.2％顯著增加至27.2±3.2％；紅景天苷預(yù)處理組心肌細(xì)胞凋亡率為12.4±1.9％，與單純?nèi)毖?

7、再灌注組比較差異顯著；加入四氧嘧啶后心肌細(xì)胞凋亡率為26.2±2.4％，與紅景天苷預(yù)處理組比較差異顯著。單純?nèi)毖?再灌注損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞ATP含量從24.2±2.0μmol/gproteion顯著下降至17.9±2.8μmol/gprotein，紅景天預(yù)處理組心肌細(xì)胞ATP含量為21.3±3.5μmol/gprotein，雖然高于單純?nèi)毖?再灌注組，但是兩組比較無(wú)顯著性差異；加入四氧嘧啶后心肌細(xì)胞ATP含量為16.7±1.6μmol/g

8、protein，與紅景天苷預(yù)處理組比較無(wú)顯著性差異。與對(duì)照組比較，缺血/再灌注損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平增加到147.2±10.5％，紅景天苷預(yù)處理后心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平從147.2±10.5％顯著降低至121.9±9.9％，與單純?nèi)毖?再灌注組比較差異顯著；加入四氧嘧啶后心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平增加至138.5±9.2％，與紅景天苷預(yù)處理組比較差異顯著。在正常氧和缺血/再灌注培養(yǎng)條件下，紅景天苷預(yù)處理均可顯著增加心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的

9、攝取率，分別為對(duì)照組的1.8倍和2.5倍，與對(duì)照組比較差異顯著；缺血/再灌注損傷亦可增加心肌細(xì)胞葡萄糖攝取率，為對(duì)照組的1.5倍，但與紅景天苷預(yù)處理組比較差異顯著，四氧嘧啶組心肌細(xì)胞葡萄糖攝取率為對(duì)照組的2.4倍，表明四氧嘧啶不抑制紅景天苷預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞葡萄糖攝取率的增加。缺血/再灌注損傷增加心肌細(xì)胞O-GlcNAc水平，為對(duì)照組的1.4倍，紅景天苷預(yù)處理可顯著增加心肌細(xì)胞中O-GlcNAc水平，為對(duì)照組的2.2倍，與單純?nèi)毖?再灌注

10、組比較差異顯著；加入四氧嘧啶后心肌細(xì)胞O-GlcNAc水平顯著下降，為對(duì)照組的0.98倍，與紅景天苷預(yù)處理組比較差異顯著。
　　結(jié)論：紅景天苷能夠顯著地減輕心肌細(xì)胞的缺血/再灌注損傷，紅景天苷預(yù)處理能夠提高細(xì)胞存活率、降低LDH漏出、抑制細(xì)胞凋亡、減輕細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、抑制ATP的消耗，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和提高細(xì)胞O-GlcNAc水平。OGT抑制劑四氧嘧啶抑制了紅景天苷對(duì)O-GlcNAc水平的提高，同時(shí)消除了紅景天苷對(duì)心肌細(xì)

11、胞的保護(hù)作用，表明紅景天苷對(duì)心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用主要是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和提高細(xì)胞O-GlcNAc水平介導(dǎo)，提高細(xì)胞ATP含量亦可能是其作用機(jī)制之一。
　　實(shí)驗(yàn)二紅景天苷對(duì)離體灌注心臟缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用
　　方法：采用Langendorff非循環(huán)灌注，灌注液為37℃、95％O2及5％CO2混合氣體飽和的KH液。建立缺血/再灌注損傷模型：平衡灌注30min，然后停止灌注30min，再?gòu)?fù)灌注30mi

12、n。18只SD大鼠隨機(jī)分為三組（n=6）：①單純?nèi)毖?再灌注組：停止灌注30min，復(fù)灌注30min；②缺血/再灌注+紅景天苷+四氧嘧啶預(yù)處理：紅景天苷80μmol/L及四氧嘧啶2.5mmol/L在停灌注前20min加入灌注液，然后按照缺血/再灌注組灌注；③缺血/再灌注+紅景天苷預(yù)處理：紅景天苷80μmol/L在停灌注前20min加入灌注液，然后按照缺血/再灌注組灌注。記錄左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率（±dP/dt）、左室發(fā)展壓（LVD

13、P）及冠狀動(dòng)脈流量（CF），收集再灌注后冠狀動(dòng)脈流出液檢測(cè)LDH釋放量，檢測(cè)心肌ATP含量、心肌細(xì)胞凋亡、O-GlcNAc水平及心肌超微結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)果：各組心臟停灌前LVDP、+dP/dt、-dP/dt和CF無(wú)顯著差異，再灌注30min后單純?nèi)毖?再灌注組、四氧嘧啶組和紅景天苷預(yù)處理組LVDP的恢復(fù)百分率分別為76.4±5.2％、73.8±5.2％和85.9±4.7％，+dP/dt的恢復(fù)百分率分別為75.2±6.3％、72.

14、9±5.8％和88.2±6.1％，-dP/dt的恢復(fù)百分率分別為79.1±4.4％、74.4±7.2％和87.4±6.8％，紅景天苷預(yù)處理組與單純?nèi)毖?再灌注組和四氧嘧啶組差異顯著。再灌注30min后單純?nèi)毖?再灌注組、紅景天苷預(yù)處理組和四氧嘧啶組CF的恢復(fù)百分率分別為76.2±5.1％、78.1±5.4％和79.6±4.9％，三組比較無(wú)顯著差異。與單純?nèi)毖?再灌注組比較，紅景天苷預(yù)處理顯著降低LDH釋放量，兩組比較差異顯著。加入四氧嘧

15、啶后LDH釋放量增加，與紅景天苷預(yù)處理組比較差異顯著。TUNEL染色顯示單純?nèi)毖?再灌注組21.3±3.5％的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而紅景天苷預(yù)處理組9.5±2.6％的細(xì)胞發(fā)生凋亡，兩組比較差異顯著；加入四氧嘧啶后細(xì)胞凋亡增加到19.8±3.1％，與紅景天苷預(yù)處理組比較差異顯著。再灌注30min后三組心肌ATP含量分別為1.48±0.18μmol/gtissue、1.42±0.13μmol/gtissue和1.51±0.17μmol/gtiss

16、ue，三組比較無(wú)顯著差異。紅景天苷預(yù)處理可顯著增加心肌中O-GlcNAc水平，為單純?nèi)毖?再灌注對(duì)照組的1.9倍，加入四氧嘧啶后抑制了紅景天苷對(duì)細(xì)胞O-GlcNAc水平的增加，O-GlcNAc水平為單純?nèi)毖?再灌注對(duì)照組的1.2倍，紅景天苷預(yù)處理組與單純?nèi)毖?再灌注組和四氧嘧啶組差異顯著。電鏡觀察顯示紅景天苷預(yù)處理組心肌結(jié)構(gòu)清晰，肌節(jié)結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞無(wú)水腫，線粒體形態(tài)、大小正常；單純?nèi)毖?再灌注組心肌超微結(jié)構(gòu)大致正常，部分細(xì)胞肌纖維攣縮，

17、線粒體略腫脹；四氧嘧啶組肌絲收縮較明顯，部分線粒體腫脹明顯，細(xì)胞內(nèi)致密顆粒增多，提示可能存在鈣超載。
　　結(jié)論：用離體心臟灌注模型可排除麻醉藥物、神經(jīng)、激素等影響心肌機(jī)械功能因素的干擾，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察了紅景天苷對(duì)離體灌注心臟缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用，紅景天苷能夠顯著地提高左心功能恢復(fù)率、降低LDH釋放量、抑制細(xì)胞凋亡和更好的保存心肌組織的超微結(jié)構(gòu)，而且紅景天苷亦能顯著提高離體灌注心臟的O-GlcNAc水平。OGT抑制劑四氧嘧啶