硝酸甘油對(duì)冠心病患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞體外增殖的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　內(nèi)皮功能障礙尤其是內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor ceils，EPCs)功能障礙參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)外周血一氧化氮(nitricoxide，NO)濃度與循環(huán)EPCs水平呈明顯正相關(guān)，提示NO與循環(huán)EPCs功能具有密切的聯(lián)系。鑒于硝酸甘油能通過(guò)提供外源性NO來(lái)模擬內(nèi)源性NO釋放系統(tǒng)的作用以及NO與EPCs增殖的密切關(guān)系，硝酸甘油極有可能促進(jìn)冠心病患者EPCs的增殖，擁有擴(kuò)血管作用

2、之外的心血管保護(hù)作用，盡管有硝酸甘油過(guò)量耐藥引起EPCs增殖和功能障礙的報(bào)道，但硝酸甘油在臨床常用的非耐藥情況下對(duì)EPCs增殖的影響無(wú)疑也具有重要的臨床意義，對(duì)此目前缺乏系統(tǒng)的研究。此外，硝酸甘油非中毒濃度范圍內(nèi)對(duì)EPCs增殖的影響機(jī)制、過(guò)量耐藥產(chǎn)生的機(jī)制和對(duì)抗耐藥的方法等問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)有系統(tǒng)的研究報(bào)道。本研究體外培養(yǎng)冠心病患者外周血EPCs，觀察不同濃度硝酸甘油刺激后，冠心病患者外周血EPCs體外增殖的變化，探索硝酸甘油對(duì)EPCs體

3、外增殖的影響及其與藥物濃度的關(guān)系，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，探討硝酸甘油在典型藥物濃度時(shí)對(duì)EPCs體外增殖影響的相關(guān)分子機(jī)制以及硝酸甘油耐藥的干預(yù)措施，以期為硝酸甘油在冠心病治療中的使用提供新的基礎(chǔ)理論依據(jù)，探討其在適宜濃度下成為促EPCs增殖藥物的可行性，并為解決硝酸甘油耐藥問(wèn)題提供新的思路。
　　方法:
　　1.取正常健康志愿者的外周血20ml/例，用密度梯度離心法從外周血獲取單個(gè)核細(xì)胞，并將其接種在人纖維連接蛋白包被的

4、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用加入血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）、鏈霉素、青霉素及胎牛血清的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，7天后收集貼壁細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察及DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍缀虵ITC標(biāo)記的荊豆凝集素對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行雙熒光染色鑒定，雙染色陽(yáng)性的細(xì)胞為正在分化的EPCs，并

5、將貼壁細(xì)胞重新接種后用MTT法描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　2.經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影等資料確診為冠心病的患者60例，取外周血20ml/例，培養(yǎng)7天后收集貼壁細(xì)胞重新接種，選擇采用不同濃度的硝酸甘油0.0mg/L（對(duì)照組）、0.3mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、7.5mg/L、15.0mg/L、20.0mg/L，對(duì)冠心病患者EPCs體外培養(yǎng)進(jìn)行干預(yù)，并用MTT法及人工計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的NO、人血管內(nèi)皮生

6、長(zhǎng)因子A和過(guò)氧化亞硝基陰離子的產(chǎn)生水平，觀察硝酸甘油對(duì)冠心病患者外周血EPCs的增殖能力的影響。
　　3.觀察在硝酸甘油典型藥物濃度7.5mg/L及20.0mg/L的基礎(chǔ)上聯(lián)用磷脂酰肌醇激酶-3(phosphatidylinositide-3-kinase，PI3K)抑制劑LY294002（在硝酸甘油干預(yù)前12小時(shí)用LY294002提前干預(yù)）對(duì)冠心病患者外周血EPCs體外增殖的影響，并檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的NO、人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

7、A和貼壁細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生水平，并用Western blotting檢測(cè)貼壁細(xì)胞的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(serine-threonone protein kinase，Akt)(Ser473)、磷酸化絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(phospho-serine-threonone protein kinase，P-Akt)(Ser473)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthetase，eNOS)(S

8、erl177)和磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(phospho-endothelial nitric oxide synthetase，P-eNOS)(Ser1177)的表達(dá)，以初步探索硝酸甘油影響EPCs增殖的機(jī)制。
　　4.在硝酸甘油中毒濃度20.0mg/L基礎(chǔ)上聯(lián)用β-巰基乙醇（在硝酸甘油干預(yù)前4小時(shí)先用β-巰基乙醇干預(yù)），復(fù)測(cè)EPCs增殖能力，活性氧的產(chǎn)生及貼壁細(xì)胞Akt(Ser473)、P-Akt(Ser473)、eNOS(S

9、er1177)和P-eNOS(Ser1177)的表達(dá)，探討β-巰基乙醇對(duì)硝酸甘油耐藥的影響及其潛在機(jī)制。
　　所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)4次，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用單因素方差分析比較組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.倒置相差顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征:培養(yǎng)24小時(shí)后單個(gè)核細(xì)胞開(kāi)始貼壁，培養(yǎng)7天的EPCs，可見(jiàn)細(xì)胞克隆周?chē)霈F(xiàn)梭形細(xì)胞;培養(yǎng)14天的EPCs

10、，可見(jiàn)呈大的集落樣生長(zhǎng)，四周梭形細(xì)胞放射狀排列;再多培養(yǎng)1-2天呈鋪路石樣改變。用DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍缀虵ITC標(biāo)記的荊豆凝集素鑒定EPCs吸附FITC標(biāo)記的荊豆凝集素呈綠色，EPCs吸附DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍壮始t色(×100)，同時(shí)吸附二者呈黃色(×100);外周血EPCs的生長(zhǎng)曲線:將分離得到的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)7天后，將貼壁細(xì)胞按2×105/ml重懸接種在96孔板中，用MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力?？梢?jiàn)細(xì)胞增殖開(kāi)始有明顯

11、的上升趨勢(shì)，從第1天到第5天（相當(dāng)于第8-12天）細(xì)胞的吸光度值表現(xiàn)為逐漸增加趨勢(shì)，尤其到第7天（相當(dāng)于第14天）的EPCs增殖能力明顯增強(qiáng)。
　　2.本研究發(fā)現(xiàn)硝酸甘油在7.5mg/L促外周血EPCs增殖達(dá)峰值，但增加硝酸甘油濃度至20.0mg/L出現(xiàn)明顯抑制增殖效應(yīng);培養(yǎng)上清液NO含量隨硝酸甘油濃度增加呈現(xiàn)濃度梯度現(xiàn)象;上清液過(guò)氧化亞硝基陰離子含量及貼壁細(xì)胞活性氧在硝酸甘油濃度≤7.5mg/L的范圍內(nèi)增加不明顯，濃度20.0m

12、g/L時(shí)明顯高于對(duì)照組;上清液血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A含量在硝酸甘油濃度7.5mg/L時(shí)達(dá)峰值，之后下降（圖4A）;7.5mg/L硝酸甘油增強(qiáng)EPCs p-eNOS(Ser1177)、p-Akt(Ser473)的表達(dá)，20.0mg/L時(shí)抑制其表達(dá)，上述藥物均對(duì)eNOS(Ser1177)、Akt(Ser473)的表達(dá)無(wú)明顯作用。說(shuō)明硝酸甘油在適量濃度釋放適量NO但細(xì)胞活性氧（主要是過(guò)氧化亞硝基陰離子）產(chǎn)生未過(guò)量，此時(shí)NO的生物利用度高，提高eN

13、OS、Akt的磷酸化水平，細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A分泌增加，EPCs增殖活躍，而過(guò)高濃度硝酸甘油釋放過(guò)量NO，細(xì)胞活性氧產(chǎn)生過(guò)多，NO生物利用度降低，抑制eNOS、Akt的磷酸化，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A分泌減少，EPCs增殖能力下降。
　　3.β-巰基乙醇能改善20.0mg/L硝酸甘油對(duì)EPCs增殖的抑制作用，降低高濃度硝酸甘油引起的貼壁細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生，并改善p-eNOS(Ser1177)、p-Akt(Ser473)的表達(dá)，但對(duì)Akt

14、、eNOS的表達(dá)無(wú)作用。
　　結(jié)論:
　　1.硝酸甘油對(duì)EPCs體外增殖的影響與濃度具有密切的關(guān)系，在適宜濃度下對(duì)EPCs增殖具有促進(jìn)作用，過(guò)高濃度下其作用趨向抑制。
　　2.適量濃度的硝酸甘油提供的外源性NO通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A的分泌來(lái)促進(jìn)EPCs增殖作用，高濃度硝酸甘油提供的過(guò)量外源性NO使過(guò)氧化亞硝基陰離子和活性氧顯著增加，損傷細(xì)胞酶系統(tǒng)，產(chǎn)生硝酸甘油耐藥，抑制p-eNOS，p-