外周血EPCs的體外培養(yǎng)及通心絡(luò)對(duì)冠心病患者外周血FPCs黏附、增殖能力的研究.pdf

1、目的：
　　 內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells)EPCs是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是各種心血管疾病的始動(dòng)環(huán)節(jié)和中心環(huán)節(jié)，EPCs不僅參與人體胚胎血管的生成，同時(shí)還有維持內(nèi)皮細(xì)胞的完整性和血管動(dòng)態(tài)平衡的功能。EPCs的減少和功能減退被認(rèn)為是未來(lái)心血管事件的預(yù)測(cè)因子。內(nèi)皮的損傷與修復(fù)之間的動(dòng)態(tài)平衡是維持其正常功能的關(guān)鍵，EPCs是參與修復(fù)的重要因素。
　　 通心絡(luò)依據(jù)中藥絡(luò)病理

2、論研究制成。研究證實(shí)通心絡(luò)能顯著改善冠心病患者血管內(nèi)皮功能，穩(wěn)定斑塊，延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程，改善冠心病患者心絞痛癥狀，改善心肌缺血，目前已廣泛應(yīng)用于臨床心腦血管疾病的預(yù)防和治療?？紤]通心絡(luò)可能通過(guò)影響EPCs促進(jìn)內(nèi)皮功能的改善，本試驗(yàn)觀察人外周血EPCs培養(yǎng)生長(zhǎng)的特征，探討改進(jìn)人外周血EPCs分離和體外培養(yǎng)的技術(shù)，找尋細(xì)胞的最佳干預(yù)期，探索人外周血EPCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)和擴(kuò)增的方法。證實(shí)人外周血是臨床治療缺血性疾病一個(gè)理想的EPCs來(lái)源，

3、為人外周血EPCs的研究奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，研究通心絡(luò)對(duì)體外培養(yǎng)的人外周EPCs黏附、增殖功能的影響，為臨床冠心病的治療中通心絡(luò)的合理應(yīng)用提供參考。
　　 方法：
　　 本研究方法圍繞著EPCs分為相互關(guān)聯(lián)的兩部分：
　　 1.人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定：無(wú)菌條件下采集冠心病患者外周血10ml，運(yùn)用Ficoll密度梯度離心法，分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)，用含有10％優(yōu)級(jí)胎牛血清的人EPCs培養(yǎng)基進(jìn)行

4、培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)所得的細(xì)胞每日在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)變化，評(píng)價(jià)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程；并進(jìn)行EPCs特征和功能的鑒定：經(jīng)激光共聚焦顯微鏡鑒定，F(xiàn)ITC-UEA-I和Dil-acLDL雙染色陽(yáng)性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs；流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志CD34、CD133進(jìn)一步鑒定為EPCs。
　　 2.通心絡(luò)對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響：在第一部分研究的基礎(chǔ)上，選擇培養(yǎng)7天的細(xì)胞進(jìn)行這一步研究。將培養(yǎng)7天的細(xì)胞消化，重懸，收集貼壁細(xì)

5、胞，貼壁細(xì)胞隨機(jī)分成7組：(1)對(duì)照組；(2)冠心病患者各濃度組(共6組)：在培養(yǎng)液中加入終濃度為50、100、200、500、750和1000μg/ml培養(yǎng)48h，其中500μg/ml組觀察不同時(shí)間(0h、12h、24h、36h、48h)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型；黏附能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EPCs的黏附能力；MTT比色法檢測(cè)EPCs的增殖能力。
　　 結(jié)果：
　　 1.將離心速度調(diào)整至1500rpm后，每毫升外周血經(jīng)Fico

6、ll密度梯度離心法分離可得到MNCs1×106～2×106個(gè)，臺(tái)盼藍(lán)染色后活細(xì)胞百分率在96±2％。培養(yǎng)后早期細(xì)胞大多為圓形或橢圓形，混有少量紡錘形細(xì)胞，第5天起，部分圓形大單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為梭形貼壁內(nèi)皮祖細(xì)胞；7天左右出現(xiàn)由數(shù)十個(gè)細(xì)胞形成的細(xì)胞集落，并可見(jiàn)到細(xì)胞呈條索狀排列；10天左右，細(xì)胞變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，相互交聯(lián)；14天后細(xì)胞開始衰老、崩解，數(shù)量減少。在培養(yǎng)的第7天，細(xì)胞生長(zhǎng)性狀最佳，通過(guò)檢測(cè)，細(xì)胞的內(nèi)皮祖細(xì)胞系特異性標(biāo)志因子CD34、CD

7、133表達(dá)良好，攝取acLDL和結(jié)合UEA-I實(shí)驗(yàn)均呈強(qiáng)陽(yáng)性。
　　 2.通心絡(luò)對(duì)外周血EPCs黏附能力的影響：通心絡(luò)明顯增加EPCs的黏附能力，呈一定的量效與時(shí)效關(guān)系，在100μg/ml濃度時(shí)開始較對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P<0.05)，于500μg/ml時(shí)達(dá)最大效應(yīng)(P<0.05)。500μg/ml作用24h后，EPCs黏附能力開始明顯增強(qiáng)(P<0.05)，48h達(dá)到高峰(P<0.05)。
　　 3.通心絡(luò)對(duì)外周血EPCs增

8、殖的影響：通心絡(luò)明顯增加EPCs的增殖能力，呈一定的量效與時(shí)效關(guān)系，在100μg/ml濃度時(shí)開始較對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P<0.05)，于500μg/ml時(shí)達(dá)最大效應(yīng)(P<0.05)。500μg/ml通心絡(luò)作用24h后，EPCs增殖能力開始明顯增強(qiáng)(P<0.05)，48h達(dá)到高峰(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、在26～37℃條件下，采用離心速度為1200rpm～1500rpm的密度梯度離心法，可以良好的分離人外周血