CD23-IgE介導(dǎo)跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)在變應(yīng)性鼻炎發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、第一部分增強(qiáng)的CD23-IgE介導(dǎo)大分子變應(yīng)原跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)參與變應(yīng)性鼻炎發(fā)病
　　研究背景:由于上皮細(xì)胞之間的緊密連接的存在，阻礙大分子變應(yīng)原（水溶性蛋白）自由通過上皮細(xì)胞層，大分子變應(yīng)原如何通過鼻黏膜上皮屏障和黏膜固有層免疫效應(yīng)細(xì)胞接觸的機(jī)制尚不清楚。一些研究表明，IgE的低親和力受體FcεRⅡ(CD23)，具有轉(zhuǎn)運(yùn)IgE和IgE變應(yīng)原免疫復(fù)合物通過極化的人單層消化道上皮的潛在功能;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)的CD23介導(dǎo)的跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)是

2、啟動消化道快速變應(yīng)性炎癥必不可少的步驟。但是人類鼻黏膜上皮是否存在同樣的跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)IgE和IgE免疫復(fù)合物機(jī)制尚不清楚。
　　目的:本課題第一部分?jǐn)M在蛋白及mRNA水平檢測變應(yīng)性鼻炎患者和正常對照患者鼻黏膜上皮CD23的表達(dá)情況，并在體外研究人鼻黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)的CD23是否具有轉(zhuǎn)運(yùn)IgE和IgE免疫復(fù)合物通過原代培養(yǎng)的人鼻上皮細(xì)胞單層的功能。
　　材料和方法:采集20名我院行鼻內(nèi)鏡手術(shù)的鼻中隔偏曲并變應(yīng)性鼻炎患者的術(shù)中矯正

3、下鼻甲黏膜組織標(biāo)本，經(jīng)鼻內(nèi)鏡腦脊液鼻漏修補(bǔ)和顱底良性腫瘤切除術(shù)患者鼻腔黏膜作為對照。應(yīng)用免疫熒光和Western Blot檢測CD23在人鼻腔黏膜組織的表達(dá);應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)法檢測CD23-IgE在鼻黏膜上皮細(xì)胞層結(jié)合位點(diǎn);應(yīng)用原位雜交的方法檢測人鼻黏膜組織CD23a、CD23b mRNA表達(dá)情況。原代培養(yǎng)人鼻黏膜上皮細(xì)胞，通過廣譜角蛋白的表達(dá)鑒定細(xì)胞的上皮源性，應(yīng)用免疫熒光和Western Blot檢測CD23在原代培養(yǎng)鼻黏膜上皮細(xì)胞

4、的表達(dá)。于transwell透性支持物原代培養(yǎng)鼻黏膜上皮細(xì)胞，形成上皮細(xì)胞單層，通過檢測跨上皮電阻和緊密連接ZO-1蛋白，確定單層細(xì)胞間緊密連接形成。應(yīng)用透性支持物上的上皮細(xì)胞單層，模擬鼻黏膜上皮屏障，檢測IgE在鼻黏膜上皮細(xì)胞單層頂面和底面之間的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，和IgE抗原復(fù)合物從鼻黏膜上皮頂面（鼻腔面）至底面單向轉(zhuǎn)運(yùn)，并阻斷CD23和IgE結(jié)合，說明上述轉(zhuǎn)運(yùn)是由CD23介導(dǎo)的，同時比較兩鐘不同源性的上皮細(xì)胞細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)的差異。
　　

5、結(jié)果:免疫熒光和Western Blot示CD23蛋白結(jié)構(gòu)性的表達(dá)于人鼻黏膜上皮細(xì)胞，在過敏狀態(tài)下其表達(dá)發(fā)生了上調(diào);免疫熒光雙標(biāo)法示CD23-IgE的結(jié)合位點(diǎn)可位于鼻黏膜纖毛柱狀上皮細(xì)胞頂面和基底面區(qū)域的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，變應(yīng)性鼻炎患者鼻黏膜組織切片可見大量結(jié)合點(diǎn)，對照患者鼻黏膜組織切片偶見;原位雜交染色顯示CD23a、CD23b mRNA均表達(dá)于人鼻黏膜上皮細(xì)胞，變應(yīng)性鼻炎患者染色強(qiáng)度明顯高于對照患者。免疫細(xì)胞化學(xué)和Western Bl

6、ot示CD23在原代的培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細(xì)胞均有表達(dá)，原代培養(yǎng)變應(yīng)性鼻炎患者鼻上皮細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度高于正常對照患者。CD23可以介導(dǎo)人IgE在透性支持物上的上皮細(xì)胞單層頂面-底面，底面-頂面的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，亦可介導(dǎo)人IgE抗原復(fù)合物從上皮細(xì)胞單層頂面轉(zhuǎn)運(yùn)至底面，阻斷CD23與IgE結(jié)合這種跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)現(xiàn)象變?nèi)?，IgE和IgE抗原復(fù)合物通過原代培養(yǎng)變應(yīng)性鼻炎患者鼻上皮細(xì)胞單層的水平高于正常對照患者。
　　結(jié)論:人鼻黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)IgE的低親

7、和力受體FcεRⅡ(CD23)，CD23可以介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)IgE和IgE免疫復(fù)合物通過鼻黏膜上皮屏障，變應(yīng)性鼻炎患者的這種跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)。
　　第二部分在動物模型中經(jīng)鼻CD23抗體干預(yù)抑制變應(yīng)性鼻炎炎癥反應(yīng)
　　目的:我們第一部分實(shí)驗(yàn)在體外證實(shí)CD23可以介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)IgE雙向通過鼻黏膜上皮細(xì)胞單層，可以介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)IgE變應(yīng)原復(fù)合物從頂面（鼻腔面）至基底面通過鼻黏膜上皮細(xì)胞單層，變應(yīng)性鼻炎患者這種跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)。然而在體內(nèi)阻斷CD23-

8、IgE介導(dǎo)跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)，是否可以抑制變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生，需要我們做進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)先行應(yīng)用免疫組化和Western Blot檢測CD23在變應(yīng)性鼻炎動物模型鼻腔黏膜的表達(dá)，然后在體內(nèi)阻斷CD23-IgE介導(dǎo)跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)，觀察其對變應(yīng)性鼻炎的影響。
　　材料和方法:6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，用卵清蛋白腹腔注射致敏，經(jīng)鼻滴入激發(fā)建立小鼠變應(yīng)性鼻炎模型。應(yīng)用免疫組化和Western Blot檢測CD23在小鼠鼻腔黏膜的表達(dá)。經(jīng)鼻滴入

9、CD23抗體B3B4阻斷CD23-IgE介導(dǎo)跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)，同時應(yīng)用同種型抗體和經(jīng)鼻類固醇激素作為治療的陰性和陽性對照。經(jīng)鼻干預(yù)后，我們通過評估變應(yīng)性鼻炎癥狀和病理組織學(xué)改變觀察干預(yù)效果;同時通過觀察血清和鼻腔灌洗液OVA特異性IgE、LTC4、ECP和IL-4水平，鼻黏膜組織中ECP水平和脾細(xì)胞反應(yīng)情況評估干預(yù)效果。
　　結(jié)果:CD23結(jié)構(gòu)性的表達(dá)于小鼠鼻黏膜上皮細(xì)胞，在過敏狀態(tài)下其表達(dá)發(fā)生了上調(diào);在體內(nèi)，CD23在鼻腔黏膜上皮細(xì)胞

10、的上調(diào)與小鼠血清IL-4水平呈正相關(guān)，小鼠鼻腔灌洗液中IgE水平與CD23在鼻腔黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)的量亦呈正相關(guān)。經(jīng)鼻吸入CD23抗體B3B4后，小鼠鼻部癥狀減輕;組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，鼻腔黏膜下嗜酸性粒細(xì)胞浸潤減少;ELISA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清及鼻腔灌洗液OVA特異性IgE、LTC4、ECP和IL-4水平降低;Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)鼻黏膜組織ECP水平同樣降低;流式細(xì)胞術(shù)示B3B4經(jīng)鼻吸入干預(yù)糾正了CD4+輔助性T細(xì)胞反應(yīng)向Th2細(xì)胞