組胺H4受體在變應(yīng)性鼻炎中的作用及其相關(guān)免疫機(jī)制的研究.pdf

1、目的：⑴比較變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)患者及健康人群組胺H4R受體在外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood monocuclear cells，PBMCs)的表達(dá)差異，探討H4R與AR的相關(guān)關(guān)系。⑵觀察組胺對單核細(xì)胞系U937細(xì)胞分泌Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子的影響，從受體和配基作用的量效關(guān)系的多個(gè)方面探討組胺H4R在介導(dǎo)組胺對U937細(xì)胞中的作用。⑶建立塵螨變應(yīng)原刺激外周血單核細(xì)胞以及PBMCs

2、的作用模式，從H4R與不同配基的作用以及與H1R比較等方面探討H4R對AR患者單核細(xì)胞及PBMCs的作用機(jī)制。觀察H4R在AR中的組織學(xué)特征，進(jìn)一步闡明H4R在AR中的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 方法：
　　 ㈠組胺H4R在變應(yīng)性鼻炎中的表達(dá)及臨床意義。
　　 對73例確診AR患者(AR組)以及30例健康人(NAR組)，用Western蛋白印跡法以及實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent

3、quantificationPCR，qRT-PCR)檢測兩組對象PBMCs中組胺H4R的蛋白表達(dá)及基因含量。用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbnent assay，ELISA)檢測AR組患者外周血血清IL-12及IL-4的含量，分析H4R的表達(dá)含量與IL-12、IL-4以及與二者比值的關(guān)系。
　　 ㈡組胺H4R對單核細(xì)胞系U937的調(diào)控。
　　 ⑴將梯度濃度的組胺分別加入生長活躍期的人骨

4、髓單核細(xì)胞細(xì)胞系U937細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測共培養(yǎng)前及共培養(yǎng)后第6h、12h、24h、48h、72h時(shí)培養(yǎng)上清液中Th1/Th2型細(xì)胞因子γ-IFN及IL-6的表達(dá)含量，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析組胺對這兩種細(xì)胞因子的影響有無劑量-效應(yīng)關(guān)系及時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，繪制相應(yīng)的曲線。
　　 ⑵綜合考慮組胺與U937細(xì)胞系生成γ-IFN及IL-6的兩條劑量-效應(yīng)曲線選擇一合適的組胺濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將生長活躍期U937細(xì)胞分別加入PBS液、組胺(10-5

5、M)、組胺(10-5M)+H1R阻斷劑Triprolidine(10-7M～10-4M四個(gè)梯度濃度)、組胺(10-5M)+H4R阻斷劑JNJ7777120(10-7M～10-4M四個(gè)梯度濃度)、或梯度濃度的H4R激動(dòng)劑4-Methylhistamine共培養(yǎng)，ELISA法檢測不同時(shí)間(0h，12h，24h、48h、72h)各培養(yǎng)上清的γ-IFN及IL-6的表達(dá)含量，分析Triprolidine以及JNJ7777120對組胺影響U937分

6、泌兩種細(xì)胞因子的阻斷作用的特點(diǎn)。
　　 ⑶依據(jù)上面實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇合適的單一濃度的上述試劑重復(fù)實(shí)驗(yàn)，U937細(xì)胞分為六組，分別加入PBS液、組胺、組胺+Triprolidine、組胺+JNJ7777120、組胺+Triprolidine+JNJ7777120、4-Methylhistamine共培養(yǎng)，每組4個(gè)重復(fù)。ELISA法檢測各試劑單一濃度，同一時(shí)間(培養(yǎng)后第24h)時(shí)上清中的γ-IFN及IL-6的表達(dá)含量。用qRT-PCR檢測

7、U937細(xì)胞組胺H1R及H4R的表達(dá)含量。分析組胺H4R在介導(dǎo)組胺對U937細(xì)胞調(diào)控中的作用，以及比較H4R與H1R在介導(dǎo)組胺生物學(xué)效應(yīng)中的相互關(guān)系。
　　 ㈢組胺H4R對變應(yīng)性鼻炎免疫調(diào)控機(jī)制初探。
　　 ⑴組胺H4R對AR單核細(xì)胞以及PBMCs的調(diào)控：無菌分離人外周血單核細(xì)胞以及PBMCs，建立塵螨刺激人單核細(xì)胞以及PBMCs的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停^察細(xì)胞培養(yǎng)上清中T輔助細(xì)胞相關(guān)因子的變化。分別抽取對塵螨過敏的AR患者及健康人

8、(Control組)的外周血，提取外周血單核細(xì)胞或PBMCs(單核細(xì)胞n=24，PBMCsn=24，均為AR組及Control組各一半的實(shí)驗(yàn)對象)進(jìn)行培養(yǎng)。將每位實(shí)驗(yàn)對象的PBMCs分為六份，分別加入PBS、塵螨變應(yīng)原(簡稱螨)、螨+Triprolidine、螨+JNJ7777120，螨+Triprolidine+JNJ7777120，螨+4-Methylhistamine共培養(yǎng)，檢測培養(yǎng)上清中γ-IFN、IL-6、IL-4(PBMCs

9、檢測，單核細(xì)胞不檢測)的含量。qRT-PCR法檢測H1R、H4R在AR患者及健康人單核細(xì)胞以及PBMCs上的表達(dá)。分析H4R對AR患者單核細(xì)胞、PBMCs的作用，以及比較H4R與H1R在介導(dǎo)組胺生物學(xué)效應(yīng)中的相互關(guān)系。
　　 ⑵組胺H4R在AR中的病理學(xué)和組織學(xué)特點(diǎn)：用HE染色、瑞氏染色、H4R免疫熒光染色對AR患者及健康人PBMCs進(jìn)行染色，了解H4R在PBMCs上表達(dá)的特點(diǎn)；用HE染色、H4R免疫熒光化學(xué)染色對AR患者及健康

10、人鼻粘膜進(jìn)行染色，了解H4R的表達(dá)的組織學(xué)特點(diǎn)。
　　 結(jié)果：
　　 ①AR患者PBMCs中H4R蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)均明顯高于健康對照組。AR患者的mRNA含量與IL-4的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.71，P＜0.01)，與IL-12的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.64，P＜0.01)，與IL-4/IL-12比值亦有顯著的相關(guān)性(r=0.84，P＜0.01)。
　　 ②組胺H1R及H4R在單核細(xì)胞系U937細(xì)胞上均有表達(dá)

11、，以GAPDH為內(nèi)參，組胺H4型受體的表達(dá)量高于H1型受體，其相對表達(dá)量分別為0.60％及0.29％。
　　 ③組胺對U937細(xì)胞的調(diào)控：組胺能呈劑量依賴性地抑制U937細(xì)胞分泌γ-IFN，同時(shí)增加U937細(xì)胞分泌IL-6(γ-IFN：F=96.14，P＜0.01，IL-6：F=134.18，P＜0.01)。組胺對U937分泌γ-IFN和IL-6的影響也具有時(shí)間依賴性(重復(fù)測量的方差分析，γ-IFN：球形檢驗(yàn)P=0.69，各時(shí)間

12、點(diǎn)差異F=18.96，P＜0.01；IL-6：球形檢驗(yàn)P＜0.01，Pillai's Trace F=113.89，P＜0.01)。
　　 ④組胺H4R介導(dǎo)組胺對U937細(xì)胞調(diào)控中的作用：組胺H4R的特異性激動(dòng)劑4-Methylhistamine能引起U937細(xì)胞的上述類似組胺的相似作用。組胺H4R特異性阻斷劑JNJ7777120能顯著性阻斷組胺對U937分泌γ-IFN和IL-6的影響。JNJ7777120對組胺抑制U937分泌

13、γ-IFN的阻斷作用有劑量依賴性(F=65.93，P＜0.01)，但無時(shí)間依賴性，對組胺刺激U937分泌IL-6的阻斷作用有劑量依賴性和時(shí)間依賴性(劑量：F=39.97，P＜0.01；時(shí)間：球形檢驗(yàn)P＜0.01，Pillai's TraceF=370.54，P＜0.01)。H1R阻斷劑Triprolidine對組胺對U937分泌上述兩種細(xì)胞因子的影響也有顯著性阻斷作用。JNJ7777120與Triprolidine二者對組胺對U937分

14、泌細(xì)胞因子的阻斷作用呈疊加(γ-IFN)或交互作用(IL-6)。
　　 ⑤組胺H4R對人外周血單核細(xì)胞及PBMCs的影響：(1)塵螨變應(yīng)原刺激能引起對塵螨過敏的AR患者外周血單核細(xì)胞及PBMCs培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子呈Th2型細(xì)胞因子IL-6、IL-4(PBMCs中)升高，Th1型細(xì)胞因子γ-IFN下降的變化，與對照組相比，三種細(xì)胞因子的變化均有顯著性差異。塵螨變應(yīng)原刺激不能引起健康人外周血單核細(xì)胞及PBMCs的類似變化。(2)組

15、胺H4R阻斷劑JNJ7777120能顯著性阻斷塵螨刺激后的AR患者外周血單核細(xì)胞及PBMCs產(chǎn)生的細(xì)胞因子γ-IFN、IL-6、IL-4(PBMCs中)的變化。H1R阻斷劑Triprolidine也有類似的影響。兩種受體阻斷劑的阻斷效應(yīng)呈疊加方式，二者沒有交互作用。H4R的激動(dòng)劑4-Methylhistamine和塵螨的聯(lián)合使用與單獨(dú)使用塵螨的效應(yīng)相似。
　　 ⑥免疫熒光染色證實(shí)組胺H4R在AR患者及健康人PBMCs及鼻粘膜均有

16、表達(dá)，H4R在AR患者鼻粘膜及PBMCs上的表達(dá)含量高于健康人。
　　 結(jié)論：
　　 ⑴AR患者的PBMCs上H4R基因水平及蛋白水平的表達(dá)均高于健康人。H4R在AR患者PBMCs上的表達(dá)與Th1/Th2型細(xì)胞因子有相關(guān)關(guān)系，AR患者H4R的上調(diào)可能參與了Th1/Th2平衡的免疫調(diào)節(jié)。
　　 ⑵H4R參與介導(dǎo)了組胺對單核細(xì)胞系U937的免疫調(diào)控作用，可改變其T輔助細(xì)胞相關(guān)因子的分泌，調(diào)控U937細(xì)胞的分化。

17、>　　 ⑶組胺H4R在塵螨變應(yīng)原通過組胺途徑對AR患者人單核細(xì)胞及PBMCs的的過敏反應(yīng)中起重要的調(diào)控作用，它介導(dǎo)了單核細(xì)胞及PBMCs產(chǎn)生的T輔助細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的分泌的改變，參與了AR的發(fā)生及發(fā)展。
　　 ⑷在介導(dǎo)組胺調(diào)控U937細(xì)胞系以及塵螨變應(yīng)原引起的過敏反應(yīng)中，組胺H4R較H1R的作用更為顯著，兩種受體對組胺的共同效應(yīng)呈疊加方式或交互增強(qiáng)方式。
　　 ⑸H4R在AR中具有靶器官的組織學(xué)特異性。