桑樹枝條韌皮部桑根皮素的制備及其對小鼠H22細胞株移植性腫瘤的抑制作用.pdf

1、本實驗主要以桑樹栽培種湖桑32號的桑樹枝條韌皮部（簡稱桑枝皮）為試驗材料，采用無水乙醇提取、大孔樹脂的吸附與分離、葡聚糖凝膠柱洗脫和半制備反相高效液相色譜（RP-HPLC）分離純化等方法，經(jīng)過高效液相色譜二級管陳列檢測（HPLC-DAD）和與標準品紫外光譜比對分析與鑒定，分離到的高純單體為桑根皮素（morusin）。以桑根皮素標準品繪制的線性方程定量分析待測樣品中桑根皮素的含量，桑根皮素在0.05-1.00μg范圍內(nèi)與其吸光度值具有很好

2、的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為 R2=0.9996。同時，應(yīng)用HPLC-DAD色譜法測定桑枝皮中桑根皮素的重現(xiàn)性和回收率分別為6.02%和100.62%。桑樹不同部位中桑根皮素的含量分析結(jié)果顯示，湖桑32的桑枝皮中桑根皮素含量與根皮中含量相差甚微，而在桑葉中沒有發(fā)現(xiàn)桑根皮素的存在；桑品種為延邊秋雨的桑枝皮中桑根皮素含量約是其根皮中的3倍。100個桑樹栽培品種的桑枝皮中桑根皮素含量差異顯著，高低可達20倍之多。湖桑32枝條皮中桑根皮素含量為200

3、.22μg/g，湖桑13號品種的桑枝皮中含量最高為585.81μg/g，而引三桑品種的枝條皮中其含量最低僅為29.64μg/g。本試驗結(jié)果表明，本文應(yīng)用的 RP-HPLC-DAD分析法對鑒定和分析桑樹或桑枝皮中桑根皮素的方法快速、可靠。我們可以從大量廢棄的桑樹枝條皮中大量提取和回收具有抗腫瘤、抗菌、抗艾滋病毒等活性成份—桑根皮素，為農(nóng)業(yè)廢棄物桑樹枝條的高效利用和高附加值的開發(fā)打下良好的基礎(chǔ)。
　　為了研究桑根皮素抗腫瘤等方面的作用

4、機制，本實驗利用分子生物學的方法，定量檢測某些相關(guān)抗腫瘤基因的表達情況。通過小鼠肝癌腫瘤細胞株的移植，建立了移植瘤H22肝癌腫瘤小鼠的模型，采用腹腔注射的治療方式，研究了桑根皮素抑制腋下 H22實體瘤荷瘤模型小鼠腫瘤的發(fā)育情況和病理組織學的變化。隨機將H22移植瘤肝癌小鼠分為5組：注射生理鹽水的模型組，注射桑根皮素低（10 mg/kg·d）、中（20 mg/kg·d）、高（40 mg/kg·d）劑量的樣品處理組，以及注射抗腫瘤藥物的5-

5、氟尿嘧啶為陽性對照組，給藥10 d，剖去瘤塊、脾臟和肝臟，計算抑瘤率及肝臟、脾臟系數(shù)增長率和體質(zhì)量增長率；采用HE染色對腫瘤和肝臟進行病理觀察；以腫瘤模型組為對照，桑根皮素低、中、高劑量注射組及5-氟尿嘧啶陽性對照組對腫瘤的生長均有不同程度的抑制作用，抑瘤率分別為13.84%、26.21%、34.43%和47.21%；肝臟和脾臟系數(shù)增長率及體質(zhì)量增長率結(jié)果顯示，桑根皮素對小鼠肝臟、腎臟和體質(zhì)量增長無明顯影響。
　　以5-氟尿嘧啶注

6、射組為實驗對照的熒光定量PCR（QPCR）定量分析研究表明，經(jīng)桑根皮素處理的 H22小鼠與模型組相比，桑根皮素各劑量注射組的 P53、Caspase-3、Survivin和CyclinB1基因表達顯著上升，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。桑根皮素低、中、高劑量治療組中Caspase-3的基因表達水平均明顯高于模型組（P＜0.01）；其低劑量組Caspase-3基因表達水平大大高于模型組達4倍以上，中、高劑量實驗組Caspase-3基因表

7、達水平雖低于低劑量組，但也分別高于模型組3.6和3.0倍。隨著注射桑根皮素濃度的上升，樣品處理組的抑制效果呈現(xiàn)下降趨勢，即呈劑量-效應(yīng)的逆向關(guān)系。荷瘤模型組中NF-κB基因表達水平最高，高劑量樣品注射組 NF-κB基因表達量最低，與模型組表達量相比下調(diào)到36.5%。這三個劑量的桑根皮素樣品注射組對 NF-κB基因表達的下調(diào)作用都達到非常顯著的水平（p＜0.01）。根據(jù)以上熒光定量分析的實驗結(jié)果，我們可以推測桑根皮素的抗肝癌作用的機制是通