瑞香素聯(lián)合DC疫苗抗小鼠移植性腫瘤H22效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　觀察瑞香素聯(lián)合樹突狀細(xì)胞（DC）疫苗對小鼠H22肝癌移植瘤抗腫瘤免疫效應(yīng)及其對荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞中抑凋亡基因Bcl-2及促凋亡基因Bax mRNA表達(dá)的影響，初步探討瑞香素聯(lián)合DC疫苗抗腫瘤的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1、采用MTT法檢測不同濃度瑞香素對人肝癌HepG2細(xì)胞和小鼠肝癌H22體外增殖的抑制作用；
　　2、體外培養(yǎng)DC并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，應(yīng)用反復(fù)凍融法制備的腫瘤細(xì)胞全細(xì)胞抗原沖擊

2、DC制備DC腫瘤疫苗；
　　3、瑞香素聯(lián)合DC疫苗的體內(nèi)抑瘤作用：建立小鼠H22肝癌荷瘤模型，將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為荷瘤對照組、5-Fu治療組、瑞香素組、DC疫苗組、瑞香素聯(lián)合DC疫苗組，另設(shè)健康對照組，每組8只，健康對照組和荷瘤對照組每鼠每天腹腔注射生理鹽水0.2mL，共14天；5-Fu組按20mg/kg·d劑量每鼠每天腹腔注射0.2mL，共14天；瑞香素組按4mg/kg·d劑量每鼠每天腹腔注射瑞香素0.2mL，共14天；DC疫苗組

3、于接種腫瘤細(xì)胞后的第1d、7d在接種部位瘤周皮下注射 DC疫苗（5×106/只）；瑞香素聯(lián)合 DC疫苗組：瑞香素按4mg/kg·d劑量每鼠每天腹腔注射瑞香素0.2mL，同時(shí)于接種腫瘤細(xì)胞后的第1d、7d在接種部位瘤周皮下注射DC疫苗（5×106/只）。第15天處死治療小鼠，計(jì)算抑瘤率、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)；
　　4、檢測小鼠NK細(xì)胞活性以及ConA誘導(dǎo)的脾T淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)（MTT法）；
　　5、HE染色，光鏡下觀察H22肝癌

4、組織病理學(xué)改變；
　　6、ELISA法檢測各組小鼠血清中細(xì)胞因子IFN-γ、ΙL-12、ΙL-4的水平；
　　7、RT-qPCR法檢測各組小鼠腫瘤組織Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、①瑞香素濃度（μg/mL）為250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.90、1.95、0.97、0.48時(shí)，作用HepG2細(xì)胞48h，其抑制率（％）分別為：63.71±2.20、62.6

5、9±0.76、61.68±1.80、59.09±1.08、56.40±1.33、47.92±1.65和28.02±2.23、20.05±1.60、16.60±1.53、10.10±1.71，IC50值（μg/mL）為21.89±0.70。
　?、谌鹣闼貪舛龋é蘥/mL）為250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.90、1.95、0.97、0.48時(shí)，作用于H22細(xì)胞48h，其抑制率（%）分別為：85.52±5

6、.15、65.04±4.72、61.04±5.94、50.77±7.40、47.26±8.49、45.21±6.37、36.52±3.53、33.55±8.26、23.62±8.67、19.79±5.47，IC50值（μg/mL）為16.89±9.64。
　　2、各用藥組對小鼠移植瘤生長均有抑制作用，以5-Fu組最為明顯。荷瘤對照組、5-Fu組、瑞香素組、DC疫苗組、瑞香素聯(lián)合DC疫苗組瘤質(zhì)量（g）分別為1.817±0.388、0

7、.424±0.309、0.833±0.314、1.206±0.523和0.493±0.306，均低于荷瘤對照組（P<0.05）。三治療組間兩兩相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），聯(lián)合治療組與5-Fu相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3、①瑞香素組、DC疫苗組、瑞香素聯(lián)合DC疫苗組脾臟指數(shù)分別是8.504±0.508、10.878±3.916和12.902±2.927，均高于荷瘤對照組7.075±0.379（P<0.

8、05）。聯(lián)合治療組高于與瑞香素組、DC疫苗組（P<0.05），但瑞香素組與DC疫苗組間無差異（P>0.05）。5-Fu組脾臟指數(shù)為5.638±1.567，低于荷瘤對照組（P<0.05）。②三治療組胸腺指數(shù)雖略高于荷瘤對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而5-Fu組胸腺指數(shù)低于荷瘤對照組和健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4、瑞香素組、瑞香素聯(lián)合DC疫苗組NK細(xì)胞活性高于荷瘤對照組和5-Fu組（P<0.05

9、），其中瑞香素聯(lián)合 DC疫苗組的最高為（64.40±9.99）%，其次為瑞香素組（59.50±10.90）%。5-Fu組則大大降低了脾淋巴細(xì)胞殺瘤活性，低于健康對照組和荷瘤對照組（P<0.05）。
　　5、瑞香素組、瑞香素聯(lián)合DC疫苗組ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)高于荷瘤對照組和5-Fu組（P<0.05）；5-Fu組ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)，低于荷瘤對照組和健康對照組（P<0.05）。
　　6、各組腫瘤組

10、織的病理學(xué)變化：
　　HE染色顯示，瑞香素聯(lián)合DC疫苗組可見大面積壞死區(qū)，較多腫瘤細(xì)胞呈細(xì)胞核碎裂，核固縮等凋亡和壞死的形態(tài)學(xué)改變；荷瘤對照組壞死區(qū)較少，且壞死面積較小，腫瘤細(xì)胞生長旺盛，壞死及凋亡細(xì)胞較少；瑞香素組和DC疫苗組亦有明顯壞死，但壞死程度較瑞香素聯(lián)合DC疫苗組明顯減輕。
　　7、治療組小鼠外周血細(xì)胞因子檢測：①三治療組血清 IL-12含量均較荷瘤對照組高（P<0.05），其中，瑞香素聯(lián)合 DC疫苗組＞瑞香素組＞

11、DC疫苗組（P<0.05）。②三治療組血清IFN-γ含量均高于荷瘤對照組和5-Fu組，其中瑞香素聯(lián)合DC疫苗組高于瑞香素組和DC疫苗組（P<0.05），但瑞香素組和DC疫苗組相比差異無顯著性（P>0.05），瑞香素聯(lián)合 DC疫苗組也高于健康對照組（P<0.05）。③三治療組血清 IL-4含量均低于荷瘤對照組（P<0.05），其中瑞香素聯(lián)合DC疫苗組又低于瑞香素組和DC疫苗組（P<0.05），瑞香素組和DC疫苗組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

12、>0.05）。
　　8、RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，瑞香素組、DC疫苗組、瑞香素聯(lián)合DC疫苗組均能下調(diào)瘤組織中Bcl-2 mRNA的表達(dá)，同時(shí)能上調(diào)瘤組織中Bax mRNA的表達(dá)，與荷瘤對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中瑞香素聯(lián)合 DC疫苗組瘤組織Bcl-2 mRNA與Bax mRNA比值最小。
　　結(jié)論：
　　1、瑞香素對HepG2細(xì)胞生長有不同程度的抑制作用，在0.48～250μg/mL濃度范圍內(nèi)呈