超聲激活血卟啉對(duì)H22腫瘤細(xì)胞抑制效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)初探.pdf

1、腫瘤，尤其是惡性腫瘤，是一種直接威脅人類生命安全的疾病，1996年全球新發(fā)惡性腫瘤病例1000多萬，我國每年新發(fā)惡性腫瘤病例160-200萬，預(yù)計(jì)今后20年這個(gè)發(fā)病率還可能再增加一倍。因此，對(duì)腫瘤的防治，是當(dāng)前世界醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究極為重要的課題。目前，防治腫瘤的常規(guī)方法有：手術(shù)治療，放射治療和化學(xué)治療等。這些方法各有利弊：手術(shù)治療是采用手術(shù)切除腫瘤，在治療早期沒有轉(zhuǎn)移和與重要臟器及大血管無嚴(yán)重粘連的腫瘤方面效果較好，但中晚期效果不佳；放射治

2、療是利用同位素衰變和加速器產(chǎn)生的射線治療惡性腫瘤，腫瘤一旦擴(kuò)散或局部侵潤廣泛，放療就達(dá)不到治療效果，且放療本身也會(huì)帶來一些近期或遠(yuǎn)期副作用；化學(xué)療法是利用化學(xué)抗腫瘤藥物治療惡性腫瘤的主要手段，但化療藥物毒副作用較大，主要有惡心，嘔吐，脫發(fā)，白細(xì)胞減少等。因此，尋找選擇性好，副作用小的防治惡性腫瘤的新方法，是當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。超聲波作為一種機(jī)械能量形式，具有穿透力強(qiáng)，定向傳播等特點(diǎn)，在物理學(xué)，化學(xué)，醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等各領(lǐng)域有著廣泛的用途，尤

3、其是在腫瘤治療中已引起國內(nèi)外的普遍關(guān)注。1989年，日本學(xué)者Umemura．S首次報(bào)道了利用超聲能夠激活血卟啉產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)，并稱之為聲動(dòng)力學(xué)療法(Sonodynamic therapy，SDT)?，F(xiàn)普遍認(rèn)為聲動(dòng)力治療是指利用超聲能夠穿透生物組織，激活癌細(xì)胞內(nèi)富集并長時(shí)間潴留的聲敏劑如血卟啉產(chǎn)生具有高氧化活性的單線態(tài)氧等自由基，引起腫瘤細(xì)胞不可逆的損傷治癌新法。由于聲敏劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的聚集性和外部超聲波照射的選擇性而對(duì)健康組織基本沒有損害

4、或損害較小，毒副作用相對(duì)也較小，無耐藥性，且可以與其它治療手段協(xié)同作用等特點(diǎn)，SDT一經(jīng)出現(xiàn)立即受到各國腫瘤研究專家們的重視，國內(nèi)外學(xué)多學(xué)者做了大量的相關(guān)研究工作，目前關(guān)于超聲激活血卟啉抗瘤效應(yīng)還處于研究階段，就超聲激活血卟啉的可行性，對(duì)腫瘤的作用效果，實(shí)驗(yàn)參數(shù)的選擇以及作用機(jī)理等進(jìn)行了探討，并取得了初步成效。 使用的輻射聲源有平面超聲，聚焦超聲等；使用聲敏劑有卟啉類，包括血卟啉，卟啉Ⅱ，ATX-70，還有非卟啉類包括抗癌藥物和

5、化療藥物等；取得聲學(xué)參量范圍：頻率 210 kHZ-2.0 MHZ，聲強(qiáng)度 150 mW/cm<'2>-3.2 W/cm<'2>；離體作用時(shí)間 15-60s，在體作用時(shí)間 2-10min；所研究的腫瘤細(xì)胞有 S180，AH130，HL-60，VX2，以及人體腫瘤細(xì)胞LiBr，K562等；關(guān)于聲動(dòng)力治療腫瘤的機(jī)制有單線態(tài)氧機(jī)制，自由基理論和空化效應(yīng)等。本論文在綜合國內(nèi)外研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期研究成果，依托國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“

6、超聲激活血卟啉抗腫瘤細(xì)胞的分子生物學(xué)機(jī)制”和“超聲激活血卟啉誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制的研究”的支持，采用頻率為1.43 MHz的聚焦超聲結(jié)合聲敏劑血卟啉對(duì)小鼠H22腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)體外的抑制效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究，取得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1．通過H22腫瘤細(xì)胞對(duì)不同濃度血卟啉吸收的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血卟啉進(jìn)入H22腫瘤細(xì)胞內(nèi)的吸收量并不隨時(shí)間延長而無限增加，可能存在相對(duì)“飽和”。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在加入不同濃度血卟啉后，達(dá)到相對(duì)飽和狀態(tài)的時(shí)間是不同的

7、，但60min-120min時(shí)，腫瘤細(xì)胞對(duì)血卟啉的吸收基本達(dá)到相對(duì)飽和狀態(tài)，因此，最佳的血卟啉孵育時(shí)間為60min。 2．通過H22腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)參量優(yōu)化篩選研究發(fā)現(xiàn)，單純超聲處理和超聲血卟啉處理H22腫瘤細(xì)胞的過程中存在著閾值聲強(qiáng)和閾值血卟啉劑量。當(dāng)聲強(qiáng)小于2 W/cm<'2>時(shí)，超聲處理對(duì)細(xì)胞存活率影響不顯著；而當(dāng)聲強(qiáng)大于2 W/cm<'2>時(shí)，超聲對(duì)細(xì)胞的殺傷作用明顯，甚至達(dá)到50％以上，而且存活率隨著聲強(qiáng)的加大而顯著下降。

8、在超聲聯(lián)合血卟啉處理時(shí)，血卟啉濃度小于50 μg/ml時(shí)，超聲與血卟啉沒有表現(xiàn)出協(xié)同殺傷作用；而大于50 μg/ml時(shí)，超聲血卟啉組與超聲組和對(duì)照組的殺傷率有極顯著差異，并且隨著血卟啉濃度的增加，差異愈加明顯，單純血卟啉對(duì)腫瘤細(xì)胞的存活率沒有影響。不同實(shí)驗(yàn)參量作用腫瘤細(xì)胞，就會(huì)產(chǎn)生不同的殺傷機(jī)制，考慮到本研究的目的，我們最終擬選擇2 W/cm<'2>聲強(qiáng)聯(lián)合100 μg/ml血卟啉處理離體H22腫瘤細(xì)胞60s，來研究處理后腫瘤細(xì)胞發(fā)生的

9、動(dòng)態(tài)生理生化變化，探討細(xì)胞死亡的機(jī)制。 3．通過對(duì)處理后H22腫瘤細(xì)胞形態(tài)和生化方面的檢測(cè)，證實(shí)1.43 MHz，2 W/cm<'2>的聚焦超聲可通過誘導(dǎo)H22細(xì)胞凋亡而致其死亡，并且凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，F(xiàn)as/FasL，Bcl-2蛋白的表達(dá)發(fā)生極其顯著的變化，提示在超聲誘導(dǎo)H22腫瘤細(xì)胞死亡的過程中可能同時(shí)存在著死亡受體和線粒體兩種凋亡途徑4．通過小鼠H22肝癌移植瘤模型的建立，研究超聲激活血卟啉對(duì)H22荷瘤小鼠的