磷脂酰膽堿的提取、純化和分析研究.pdf

1、磷脂酰膽堿(phosphotidylcholine，PC)是磷脂中起重要營養(yǎng)保健作用的主要成分，具有非常重要的生物學(xué)活性。磷脂酰膽堿，俗名卵磷脂，由甘油基、脂肪酸基團、磷酸基和膽堿構(gòu)成。不僅為人體生長發(fā)育提供必需的磷元素，而且還是膽堿和必需脂肪酸的主要來源，而膽堿對于人腦的發(fā)育形成和維持腦正常功能不可缺少。它還含有親水的磷脂基團和親油的脂肪酸基團，是典型的兩性化合物，有著良好的乳化功能。在醫(yī)學(xué)上有很高的醫(yī)用價值，能預(yù)防和治療高血脂、高膽

2、固醇、脂肪肝，在保護細胞膜、抗氧化、抗衰老等方面起著重要作用。另外，在化工、輕工、食品工業(yè)等方面應(yīng)用很廣。 本文以大豆油脂加工的副產(chǎn)品濃縮磷脂為原料，深入探索高含量PC的提取純化方法，主要研究了全溶劑法、超臨界CO2法、柱層析法等，為中試生產(chǎn)提供理論依據(jù)；關(guān)于檢測方法，主要研究了HPLC法、TLC法測定PC，具有非常重要的經(jīng)濟價值和理論意義；對柱純化后的收集液進行純度鑒定、光譜分析及其脂肪酸種類的測定，以大致確定PC的分子結(jié)構(gòu)。

3、主要研究內(nèi)容與所得結(jié)果如下： 1.采用全溶劑法提取純化PC。先用丙酮除去原料中的脂肪酸和部分雜質(zhì)，得到淡黃色粉末狀磷脂，以室溫下提取3～4次為宜；再用乙醇試劑提取，以分光光度法測定的磷含量為評價指標，通過均勻設(shè)計優(yōu)化試驗條件，考察了提取溫度、提取時間、乙醇濃度和料液比四因素對提取的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇濃度對提取得率有顯著影響，最佳工藝條件為：100％無水乙醇，料液比1∶8，在50℃熱水浴中提取25min，產(chǎn)品經(jīng)HPLC法測定，PC

4、含量為33.4％；采用乙醇冷凍提取法，以HPLC法測定的PC含量為評價指標，通過正交實驗設(shè)計考察乙醇濃度、料液比和提取時間等因素在不同水平下對PC含量的影響，并進行方差分析和顯著性檢驗，結(jié)果顯示最佳工藝組合為A2B3C3，即93％乙醇溶液，料液比1∶3，冷凍條件下提取8.5h，在此純化條件下PC的含量提高到了75％，得率為18％左右。 2.采用超臨界CO2法純化PC。以丙酮處理過的產(chǎn)品作原料，采用超臨界CO2法進行提取，可以提取

5、出油脂，但丙酮不溶物含量測定提高不明顯，可能原料中的油脂含量低；為了考察超臨界法萃取PC的可行性，以處理過的產(chǎn)品為原料，使用夾帶劑無水乙醇，再次進行提取，以HPLC法檢測結(jié)果為依據(jù)，考察了提取次數(shù)、提取溫度、提取壓力及夾帶劑用量對PC提取的影響，結(jié)果顯示，隨著提取溫度、提取次數(shù)、夾帶劑用量的增加，PC得率增加，提取壓力增加時，PC得率先增加后下降；隨著提取次數(shù)、夾帶劑用量的增加，PC純度先增加后減少，提取溫度的增加使PC純度呈下降趨勢，

6、但提取壓力增加時，PC純度先下降后增加。通過初步考察，超臨界法萃取PC還待進一步研究。 3.采用柱層析法純化PC。以PharmadexLH-20為填料，進行柱層析可以純化PC，得到比較理想的產(chǎn)品，經(jīng)HPLC分析歸一化后純度至少在97％以上，洗脫使用單一試劑乙醇或者甲醇，洗脫時間短，洗脫劑用量約為180mL，并可回收反復(fù)使用，處理樣大，產(chǎn)品濃度高。 4.建立了分光光度法測定卵磷脂含量的方法，采用硝酸-高氯酸-雙氧水消解方法

7、，安全，簡便，易行；使用定磷試劑(18％硫酸溶液∶2.5％鉬酸銨溶液∶水∶10％抗壞血酸=1∶1∶2∶1)顯色，實驗結(jié)果可靠，重現(xiàn)性好，回收率在95-105％之間；整個操作簡單，方便，適于簡陋條件的快速測定。 5.建立了HPLC法測定PC含量的方法，色譜條件為：色譜柱為μ-Porasil(300mm×4.6mm，5μm)；流動相為乙腈∶甲醇∶85％磷酸=7∶1∶0.08；檢測波長為205nm；進樣量為20μL；流速為0.8mL/

8、min，方法快速，準確，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性結(jié)果滿意，加樣回收率在95％-100％之間。 6.摸索了TLC法測定PC的的方法，最佳條件為：展開劑為氯仿∶甲醇∶冰乙酸=24∶18∶0.04，磷鉬酸乙醇液噴霧顯色。 7.對柱純化樣，采用多種手段進行純度分析和光譜分析，并通過GC-MS測定樣品的脂肪酸側(cè)鏈種類，結(jié)合MS譜圖，研究了PC可能的分子組成。 采用HPLC法測定其PC含量為99.05％；在薄層板上展開，顯色后為單個斑

9、點，Rf值與對照品PC相仿；其紫外光譜圖最大吸收波長為202nm，與文獻報道相符；紅外光譜圖的結(jié)構(gòu)分析也證實純化物有C=O、N-C、P-O-C等結(jié)構(gòu)；柱純化樣和SIGMA公司PC標準品的MS譜圖相似；因此可以認為分離出來的樣品為純品，且為PC。 通過GC-MS分析樣品的脂肪酸側(cè)鏈種類，結(jié)果顯示含有肉豆蔻酸、棕櫚酸、亞油酸、亞麻酸、硬脂酸，其中棕櫚酸、亞油酸、硬脂酸占很大比例。分析純化樣的MS譜圖，并結(jié)合脂肪酸測定結(jié)果，純化樣中主