細菌磷脂酰膽堿與細菌表面抗原相關(guān)性的初步研究.pdf

1、為了深入了解磷脂酰膽堿的生物學(xué)功能,探討其是否與細菌致病性相關(guān),本研究通過建立在大腸桿菌細胞膜中表達磷脂酰膽堿并部分替代磷脂酰乙醇胺的試驗菌株來探討磷脂酰膽堿與細菌表面抗原存在的一定相關(guān)性。本課題主要做了如下幾方面的研究。 1、E.coli Top10pcs+試驗菌株與對照菌株的構(gòu)建 從已構(gòu)建的表達載體pET23a-pcs上擴增出帶有組氨酸標(biāo)記的pcs基因并克隆到表達載體ptac85-pcs,將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli

2、 Top10篩選得到重組子E.coli Top10pcs+。同時構(gòu)建不含pcs基因的對照菌株E.coli Top10/ptac85。經(jīng)TLC鑒定,E.coli Top10pcs+中合成產(chǎn)物PC,而對照Ecoli Top10/ptac85不合成PC。為了優(yōu)化PC的表達量,我們通過調(diào)節(jié)IPTG與膽堿的使用濃度以及誘導(dǎo)時間來優(yōu)化。試驗表明,當(dāng)細菌的OD600達到0.6-0.9時加入0.5 mmol/LIPTG進行誘導(dǎo),加入1.0％膽堿,37℃

3、誘導(dǎo)培養(yǎng)4-8小時,磷脂酰膽堿(PC)的合成量達到最高,可以占到大腸桿菌細胞膜磷脂組分的30％左右。 2、試驗菌株與對照菌株脂多糖(LPS)之間的差異比較 通過使用改進的酚水法抽提E.coli Top10pcs+和E.coli Top10/ptac85的脂多糖(LPS),電泳分離銀染后發(fā)現(xiàn),對照菌株與E.coli Top10 pcs+菌株之間LPS電泳帶存在著明顯差異,主要表現(xiàn)在25KD,14.4KD到18.4KD之間。

4、將E.coli Top10pcs+和E.coli Top10/ptac85滅活后分別免疫新西蘭大白兔后制備得到免疫血清,將免疫血清與兩種LPS分別進行Western-blot雜交。結(jié)果顯示:E.coli Top10/ptac85的免疫血清分別與E.coli Top10/ptac85的LPS、E.coli Top10pcs+的LPS雜交,在分子量為18.4 KD-30 KD雜交帶顏色較深,而E.coli Top10 pcs+的免疫血清分別

5、與E.coli Top10pcs+的LPS、E.coli Top10/ptac85的LPS雜交,分子量為14.4 KD-18.4 KD的雜交帶顏色較深。Western-blot的結(jié)果提示含有PC和不含PC細菌之間的免疫原性有一定差異。 3、試驗菌株與對照菌株感染小鼠后體重及腹腔內(nèi)巨噬細胞數(shù)量的變化 將E.coli Top10 pcs+和E.coli Top10/ptac85分別接種小鼠腹腔感染小鼠,比較小鼠感染后的體重變

6、化及腹腔內(nèi)巨噬細胞的數(shù)量變化。結(jié)果顯示：在感染后的前36小時,被E.coli Top10/ptac85感染的小鼠體重明顯減輕,而被E.coil Top10pcs+感染的小鼠體重則緩慢增加；被E.coli Top10/ptac85感染后小鼠腹腔內(nèi)誘導(dǎo)巨噬細胞的數(shù)量明顯多,而E.coli Top10 pcs+誘導(dǎo)的巨噬細胞則較少。但是在感染后期,E.coli Top10/ptac85和E.coliTop10 pcs+感染的小鼠體重都緩慢增加