蛋白質(zhì)組肽段鑒定質(zhì)量控制方法的研究與應用.pdf

1、隨著人類基因組測序的完成，為從整體上掌握生命現(xiàn)象的本質(zhì)和規(guī)律，生命科學對生命活動功能的真正執(zhí)行者--蛋白質(zhì)展開了全面研究，蛋白質(zhì)組學成為后基因組時代生命科學研究的熱點之一。生物質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展為蛋白質(zhì)組研究提供了高通量、高靈敏度和高分辨率的分析平臺，成為蛋白質(zhì)組學研究的支撐技術(shù)之一，并直接促成了大規(guī)模蛋白質(zhì)組研究的開展。而串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)庫搜索策略鑒定蛋白質(zhì)，可以滿足組學研究高通量、自動化的要求，已成為人類蛋白質(zhì)組表達譜研究的重要技術(shù)

2、路線。
　　 數(shù)據(jù)庫搜索策略極大地增強了生物質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解析效率，但由于生物樣品的多樣性和實驗過程的復雜性，以及現(xiàn)有搜索算法的局限性，使其不能完全解決蛋白質(zhì)鑒定問題，導致質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析一直是蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)處理的難點。數(shù)據(jù)庫搜索策略存在的問題主要可以概括為兩點：即如何保證鑒定結(jié)果的完整性和正確性。
　　 本研究致力于解決質(zhì)譜數(shù)據(jù)蛋白質(zhì)鑒定的正確性問題，針對數(shù)據(jù)庫搜索策略鑒定肽段結(jié)果的質(zhì)量控制展開，在保證肽段置信度的基礎(chǔ)上，實現(xiàn)有

3、效地區(qū)分正確/錯誤的鑒定結(jié)果。數(shù)據(jù)庫搜索過程中主要由于模糊匹配和隨機匹配兩種情況存在導致陰性結(jié)果的產(chǎn)生，本研究也正是從這兩方面著手。同時，本研究還著重考慮了質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)量控制研究所面臨的下面幾個挑戰(zhàn)：
　　 1．質(zhì)譜數(shù)據(jù)復雜程度高，數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果易受質(zhì)譜儀器類型、圖譜產(chǎn)生參數(shù)、搜庫參數(shù)、數(shù)據(jù)庫大小構(gòu)成等多方面因素影響，充分利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)中所包含的信息將有利于全面完整地描述數(shù)據(jù)集特征；
　　 2．如何建立客觀的評價體系，既考慮

4、數(shù)據(jù)集整體置信度水平，又能體現(xiàn)肽段的“個性”，為實驗人員提供單個肽段/蛋白鑒定結(jié)果的正確概率；
　　 3．保證所發(fā)展模型和方法的通用性及普適性，實現(xiàn)有效分析、整合多種來源的海量復雜數(shù)據(jù)；
　　 4．高精度質(zhì)譜數(shù)據(jù)已成為生物質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展的趨勢，如何針對高精度質(zhì)譜數(shù)據(jù)的特點解析結(jié)果將成為質(zhì)譜信息學的發(fā)展方向。
　　 本文針對數(shù)據(jù)庫搜索策略鑒定肽段質(zhì)量控制所面臨的上述問題，考慮兩種肽段水平產(chǎn)生陰性結(jié)果的原因，基于隨機數(shù)

5、據(jù)庫搜索策略，對不同精度質(zhì)譜儀器數(shù)據(jù)以及SEQUEST和Mascot兩種最常用數(shù)據(jù)庫搜索引擎的結(jié)果展開質(zhì)控方法研究，提高了肽段過濾過程的靈敏度和實用性，并構(gòu)建了大規(guī)模蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的質(zhì)控分析流程，為后續(xù)生物學問題研究提供更可信、更完備的肽段和蛋白質(zhì)列表。
　　 首先，利用標準蛋白數(shù)據(jù)集和理論模擬譜圖集獲得常規(guī)數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果模糊匹配的基本模式，以及在不同精度數(shù)據(jù)集中的出現(xiàn)頻率，并考察了不同數(shù)據(jù)庫搜索質(zhì)量誤差設(shè)置對模糊匹配的影響。同時

6、，通過構(gòu)建包含人和非人物種蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，初步估計了實際樣品數(shù)據(jù)集中模糊匹配發(fā)生的概率。我們認為模糊匹配主要受到數(shù)據(jù)集母離子精度的影響，對標準蛋白數(shù)據(jù)集應采用和樣品蛋白同源性小的序列庫作為搜索數(shù)據(jù)庫能更真實的評估算法性能，而對于實際樣品數(shù)據(jù)集可以通過把無法區(qū)分的鑒定肽段合并不做取舍，來提高蛋白質(zhì)裝配的準確性。
　　 然后，針對隨機匹配問題，分別對高精度LTQ-FT質(zhì)譜數(shù)據(jù)、SEQUEST和Mascot軟件的數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果，通過

7、發(fā)展新搜庫策略和過濾方法有效改進了其肽段水平的質(zhì)控性能。
　　 LTQ-FT是一種兼具高精度和高通量的質(zhì)譜平臺，被廣泛地應用于蛋白質(zhì)組學定性和定量分析中，但是該儀器時間依賴的系統(tǒng)誤差會因為數(shù)據(jù)庫搜索時無法確定合理的質(zhì)量誤差范圍而使其精度大打折扣。我們詳細分析了LTQ-FT質(zhì)譜平臺母離子質(zhì)量誤差分布的特點，改進了現(xiàn)有校正公式，并開發(fā)了自動化校正的工具。同時，我們提出了一種全新的數(shù)據(jù)庫搜索策略--大誤差搜庫小誤差過濾，用于數(shù)據(jù)庫搜索

8、誤差規(guī)范和搜庫結(jié)果確認，通過在標準蛋白數(shù)據(jù)集和實際樣品數(shù)據(jù)集上的應用，證明了該策略可以顯著提高鑒定肽段過濾方法的靈敏度。
　　 基于隨機數(shù)據(jù)庫策略和非參概率密度模型，我們發(fā)展了一種用于過濾鳥槍法蛋白質(zhì)組串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)SEQUEST軟件肽段鑒定結(jié)果的方法--貝葉斯非參模型(BNP)。共提取了28個描述搜庫結(jié)果及其匹配信息的特征參數(shù)，利用多元線性回歸、期望最大算法和貝葉斯公式完成了肽段局部發(fā)現(xiàn)假陽性率的估計，并給出其過濾門限。將模型應

9、用于三批標準蛋白和五批實際樣品（包括LCQ、LTQ和LTQ-FT三種儀器的數(shù)據(jù)）串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)集的SEQUEST搜庫結(jié)果中，并與動態(tài)卡值法、PeptideProphet以及簡單非參模型比較，在給定期望假陽性率下，BNP模型能得到最多的過濾肽段數(shù)，說明了該模型較好的靈敏度和普適性，并且根據(jù)BNP模型計算的概率分值可以保留相當一部分被其他方法過濾的高可信肽段結(jié)果，從而大大提高了質(zhì)譜數(shù)據(jù)的利用效率。
　　 Mascot作為與SEQUES

10、T齊名的另外一種常用的搜庫軟件，因為種種原因?qū)ζ滂b定肽段的質(zhì)控研究較少，基于Mascot一致性閾值可以嚴格控制結(jié)果的假陽性率，但是其低靈敏度會帶來較高的假陰性率，造成大量真實結(jié)果的丟失。我們對現(xiàn)有Mascot鑒定結(jié)果的過濾和評估方法進行了分類總結(jié)，并基于隨機數(shù)據(jù)庫搜索策略，通過應用概率模型整合新特征參數(shù)完善了Mascot肽段水平的質(zhì)量控制，有效提高了Mascot搜庫結(jié)果質(zhì)控的敏感性，降低了假陰性率并增加了高可信鑒定肽段數(shù)目。
　　

11、 隨著人類蛋白質(zhì)組計劃研究的迅速發(fā)展，在實驗儀器和技術(shù)不斷進步的同時，也產(chǎn)生了大量的異質(zhì)數(shù)據(jù)。為有效整合多來源實驗數(shù)據(jù)，我們基于貝葉斯非參模型構(gòu)建了大規(guī)模質(zhì)譜數(shù)據(jù)統(tǒng)一質(zhì)控標準的分析流程，完成了中國人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃中小鼠肝臟細胞器表達譜數(shù)據(jù)集的系統(tǒng)分析，改進了表達譜常規(guī)分析策略的鑒定結(jié)果。
　　 在蛋白質(zhì)組研究中，應用質(zhì)譜實驗數(shù)據(jù)獲得高可信的鑒定結(jié)果對于后續(xù)的生物學和臨床學應用意義重大，因此如何有效地控制鑒定肽段的假陽性率仍