基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)處理及檢索質(zhì)量控制研究.pdf

1、本論文的主要貢獻:1.建立了復旦大學蛋白質(zhì)組研究中心實驗平臺的數(shù)據(jù)模板,并應用于人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃(Human Liver Proteome aroject,HLPP)的數(shù)據(jù)交流和管理,為大規(guī)模實驗數(shù)據(jù)管理和交流的標準化提供了實際經(jīng)驗和實現(xiàn)思路；2.基于2-DE(二維電泳)-MALDI-TOF/TOF(基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜)及類似的以蛋白質(zhì)為最終分離單元的組學實驗,提出了一種優(yōu)化的搜索策略,避免了因共享質(zhì)荷比所產(chǎn)生的假陽性結果

2、,同時采用迭代搜索全面反映單元內(nèi)的蛋白存在；3.針對MALDI-TOF/TOF的相關數(shù)據(jù),通過圖譜特征變量的提取和線性判別分析(Linear Discriminant Analysis,LDA),建立了PMF(PeptideMass Fingerprint)和PFF(Peptide Fragment Fingerprint)圖譜的評價模型,并應用于檢索質(zhì)量控制研究中；4.為配合人類肝臟蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)分析,構建了四個參考數(shù)據(jù)集:人類及小鼠

3、肝臟蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集、健康人血漿蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集、健康人心臟蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)集以及肝病相關基因及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集；5.應用液相等電聚焦預富集方法(Liquid-phase Isoelectric Focusing,LIEF)對小鼠肝臟蛋白質(zhì)組進行分析,證明了LIEF和多實驗路線結合的策略在復雜樣本蛋白質(zhì)組學研究中的優(yōu)勢。
　　 在復雜的生命過程中,蛋白質(zhì)是各種生命活動的具體實現(xiàn)者。1994年Williams正式提出了蛋白質(zhì)組的概念,199

4、5年Willkins正式提出了“Proteome(蛋白質(zhì)組)”的專業(yè)術語及其定義。十余年來,蛋白質(zhì)組學蓬勃發(fā)展,已成為生命科學、化學、信息科學等領域研究的重點與交叉的熱點,被廣泛地應用于各類模式生物和人類的探索之中。隨著生物質(zhì)譜技術的成熟,尤其是電噴霧(ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI)等接口技術在20世紀后期的突破性發(fā)展,質(zhì)譜檢測滿足了高通量、高分辨率的要求,逐漸替代了先前的Edman測序等生物化學手段進而成為蛋白質(zhì)組鑒定的首選

5、平臺。但從蛋白質(zhì)組學的發(fā)展現(xiàn)況來看,由于分離和檢測過程還存在諸多的不完善,實驗結果往往受蛋白質(zhì)分離效果、豐度、化學特性等因素的影響；而各類檢索算法也或多或少的存在缺陷。它們導致檢索結果中常伴隨有假陽性(False Positive)和假陰性(False Negative)的問題。而其解決需要實驗科學和信息科學雙方面的努力,其中除實驗技術不斷改進和發(fā)展外,數(shù)據(jù)處理流程的優(yōu)化及檢索質(zhì)量的控制至關重要,但至今仍缺乏公認的理想數(shù)據(jù)處理范本。本文

6、基于復旦大學蛋白質(zhì)組研究中心的生物質(zhì)譜平臺,對目前蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)處理流程中所涉及的數(shù)據(jù)標準化管理、檢索策略的優(yōu)化和質(zhì)量控制等重要方面,進行了系列嘗試,為進一步提高蛋白質(zhì)鑒定的可靠性,以及更精確地展示生物樣本的蛋白質(zhì)組提供了理論依據(jù)和實現(xiàn)思路。
　　 論文共分六章,內(nèi)容摘要如下:
　　 第一章:前言。概述了蛋白質(zhì)組學的發(fā)展歷程,對目前主要的技術體系和發(fā)展方向進行了評述。其中對蛋白質(zhì)組學研究中所涉及的數(shù)據(jù)處理方法,進行了詳細的

7、綜述,主要包括:數(shù)據(jù)處理流程、數(shù)據(jù)檢索軟件的分類及簡介、數(shù)據(jù)處理所面臨的挑戰(zhàn)和目前研究的熱點等。基于這些總結和評述,提出了本文的研究方向和思路。
　　 第二章:蛋白質(zhì)組實驗流程及數(shù)據(jù)標準化管理初探。針對HLPP中復旦大學相關儀器設備與產(chǎn)出數(shù)據(jù)的特點,基于PSI(The Proteomics Standards Initiative)原則,對實驗流程和數(shù)據(jù)產(chǎn)出進行了信息抽提,并建立了相關的數(shù)據(jù)模板。其中,所涉及的實驗流程包含了目前

8、主流的實驗平臺,數(shù)字化地反映了雙向凝膠電泳(2-DE)、多維液相(MDLC)等分離技術及MALDI、ESI質(zhì)譜的實驗參數(shù)和數(shù)據(jù)參數(shù)。模板已應用于HLPP實際的數(shù)據(jù)交流和管理中,并為標準化管理大規(guī)模實驗數(shù)據(jù)提供了實際經(jīng)驗。
　　 第三章:大規(guī)模質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析中的非同質(zhì)荷比迭代檢索規(guī)則。由于目前分離過程尚無法保證每一分離單元只含一種蛋白質(zhì),因而常影響到后續(xù)的搜索過程,并產(chǎn)生假陽性或假陰性的匹配結果。在本章工作中,通過數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計和對實驗

9、數(shù)據(jù)的模擬匹配,發(fā)現(xiàn)檢索結果之間質(zhì)荷比的共享是產(chǎn)生假陽性的重要原因。因此,本文提出了一種優(yōu)化的檢索策略,首先以改進的半小數(shù)規(guī)則和頻度限制對質(zhì)譜進行去噪處理,然后以匹配分數(shù)高低及是否包含共享質(zhì)荷比作為可信結果的評判標準,再將質(zhì)譜文件中己匹配的質(zhì)荷比進行過濾,產(chǎn)生新的質(zhì)譜搜索文件并進行迭代搜索,直到?jīng)]有可信結果產(chǎn)出為止。為進一步保證結果的可信度,反轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)庫方法也被用于其中。在標準蛋白實驗和法國人肝蛋白質(zhì)組實驗中的應用顯示,非同質(zhì)荷比迭代規(guī)則

10、和反轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)庫方法的結合可以更全面地反映蛋白質(zhì)組的組分,同時賦予了檢索結果更好的可信度。至此,為2-DE—MALDI TOF/TOF及類似實驗平臺,提供了一套系統(tǒng)可信的數(shù)據(jù)分析方法。
　　 第四章:MALDI TOF/TOF質(zhì)譜圖譜的質(zhì)量評價及其在檢索質(zhì)量控制研究中的應用。作為生物質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析的根本,質(zhì)譜圖譜的質(zhì)量與檢索結果之間息息相關,但目前相關研究所涉及的數(shù)據(jù)基本來源于離子阱質(zhì)譜(主要為LTQ,LCQ)的串級數(shù)據(jù),對于PMF圖

11、譜及基于MALDI TOF/TOF的串級數(shù)據(jù)的評價則非常少見。本文基于MALDI TOF/TOF所產(chǎn)生的大規(guī)模數(shù)據(jù),通過圖譜特征變量的提取和線性判別分析,建立了相應的PMF和PFF數(shù)據(jù)的評價模型。在評價模型的基礎上,通過反轉(zhuǎn)庫分析方法,進一步討論了PMF圖譜與相關PFF圖譜質(zhì)量之間的影響關系、圖譜質(zhì)量與蛋白質(zhì)檢索鑒定之間的關系,最終定義了WellQuality指數(shù),對源于同一分離單元的PMF和PFF的質(zhì)量進行了統(tǒng)一的評價。結果顯示,質(zhì)譜

12、質(zhì)量是決定蛋白質(zhì)匹配是否成功的決定性因素,好的圖譜往往是高質(zhì)量匹配的先決條件。Well Quality指數(shù)可以很好地反映分離單元質(zhì)譜檢測的優(yōu)劣,其指數(shù)與鑒定成功率和得分之間存在著明顯的線性關系。此外,對于質(zhì)量較好的圖譜,隨機匹配的可能性也在增加,因此本文同時采用了一種新的分數(shù)背景扣除方式進行質(zhì)量控制,取得了良好的效果。MALDI TOF/TOF圖譜的質(zhì)量評價為蛋白質(zhì)鑒定的質(zhì)量控制提供了新的思路,同時也對蛋白質(zhì)組學實驗優(yōu)化和機理研究提供了

13、新的途徑。
　　 第五章:肝臟蛋白質(zhì)組參考數(shù)據(jù)集的建立及初步分析。對于組織樣本的大規(guī)模蛋白質(zhì)組研究方興未艾,所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量極其可觀。本章針對肝臟、血漿、心臟的蛋白質(zhì)組和肝病相關基因及蛋白質(zhì)的研究,建立了相關的參考數(shù)據(jù)集,并進行了初步分析。為保證數(shù)據(jù)的完備性和可靠性,基于NCBI PubMed醫(yī)學文獻數(shù)據(jù)庫,采用人工搜索和判讀的方式,對近年發(fā)表在國際知名雜志上的相關研究成果進行了遍歷查詢,并盡可能提取蛋白質(zhì)組研究的相關參數(shù)。最終構

14、建成四個參考數(shù)據(jù)集:人及小鼠肝臟蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集、健康人血漿蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集、健康人心臟蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)集以及肝病相關基因及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)集的初步分析表明:各數(shù)據(jù)集的蛋白質(zhì)存在一定的交互,而HLPP數(shù)據(jù)集對各參考數(shù)據(jù)集的覆蓋均非常大。這樣的重疊很可能反映了機體內(nèi)各組織器官間的一些共性。同時作為機體最為重要的代謝器官,肝臟合成了很大部分的血漿蛋白,數(shù)據(jù)集間的高度交蓋暗示了肝臟對于人體的重要性。這些數(shù)據(jù)的收集和整理對相關科學研究提供了系統(tǒng)可信

15、的數(shù)據(jù)參考,有助于相關研究的深入和發(fā)展。
　　 第六章基于液相等電聚焦預富集方法(LIEF)的小鼠肝臟蛋白質(zhì)組研究及數(shù)據(jù)分析。預分離技術已被證明可大大促進蛋白質(zhì)的鑒定效果,對低豐度蛋白尤其明顯。本章通過LIEF技術對小鼠肝臟中的蛋白質(zhì)進行了預富集,并結合二維凝膠電泳(2-DE)和一維反相色譜(SDS-PAGE RPLC)分析策略對富集的蛋白質(zhì)進行了分析。結果表明:LIEF技術可大大增加后續(xù)2-DE分析中蛋白質(zhì)斑點的數(shù)目,同時大幅