肺癌血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究中高豐度蛋白質(zhì)的去除及徑HPLC分離后的譜圖分析.pdf

1、血清蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的重要分支,在蛋白質(zhì)組學(xué)的眾多的研究對象中,由于血清蛋白質(zhì)所具有的獨特的性質(zhì)、重要的生理生化功能及研究意義,因此長期以來一直是人們研究的熱點。本課題旨在建立血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究中去除高豐度蛋白質(zhì)(HAP)的方法,然后在此基礎(chǔ)上建立高效液相色譜指紋圖譜方法學(xué)并探討其在肺癌研究中的初步應(yīng)用。
　　 本實驗進(jìn)行了血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究中離心超濾法去除血清大分子量高豐度蛋白質(zhì)的研究。實驗中將非小細(xì)胞肺癌患者血清

2、與20％(v/v)乙腈以體積比1:4混合,將混合后的血清分別加入截留標(biāo)準(zhǔn)分子量(MWCO)為100,000、50,000、30,000、10,000超濾管中,8000×g,離心15min,濾液真空冷凍干燥后,以超純水按濃縮10倍復(fù)溶,分別應(yīng)用Tricine-SDS—PAGE和二元梯度高效液相色譜法(HPLC)分析比較血清大分子量高豐度蛋白質(zhì)的去除效果。電泳分離結(jié)果顯示,與100,000超濾管相比,50,000、30,000、10,000

3、濾過液中大分子量高豐度蛋白質(zhì)條帶明顯變窄,而且明顯看出隨著膜孔徑的減小,保留的蛋白質(zhì)的分子量也跟著降低。且經(jīng)離心超濾后,HPLC檢測結(jié)果顯示,選用MWCO為50,000的超濾管分離后,血清低豐度蛋白質(zhì)(LAP)分離良好,信息量保留較多,進(jìn)一步研究其重復(fù)性,相對保留時間和相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為<0.45％和<5.14％。離心超濾法去除血清中大分子量HAP步驟簡便同時兼有富集小分子量LAP的效果。
　　 本實驗建立

4、了血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究中去除血清清蛋白的乙腈沉淀技術(shù)。血清經(jīng)除脂后按血清:水:乙腈=1:2:4.5(v/v/v)比例沉淀分離高豐度清蛋白,應(yīng)用SDS-PAGE驗證去除效果和重復(fù)性,并分別對4名健康體檢者和非小細(xì)胞肺癌患者去除清蛋白前后的凝膠電泳圖像進(jìn)行分析,最后將同一份非小細(xì)胞肺癌患者血清與健康體檢者血清同時分別應(yīng)用離心超濾和乙腈沉淀處理,并應(yīng)用HPLC分離處理后的血清。結(jié)果顯示經(jīng)本法去除后,血清清蛋白平均濃度由50.65±2.82 g/

5、L下降為2.50±0.71 g/L,占血清總蛋白比例由65.1％下降為33.3％,去除前后相比有明顯差異。與等量上樣原血清電泳結(jié)果相比,相對分子量80,000以上的大分子量蛋白被去除,清蛋白條帶明顯變窄,而被其掩蓋的LAP得以顯現(xiàn),分別對4名健康體檢者和非小細(xì)胞肺癌患者去除清蛋白前后的凝膠電泳圖像進(jìn)行分析結(jié)果顯示方法重復(fù)性良好,對比經(jīng)兩種方法處理血清的HPLC譜圖發(fā)現(xiàn)乙腈沉淀法在去除大分子量HAP的同時不影響小分子量LAP的保留,而且與

6、離心超濾法相比可以保留更多蛋白質(zhì)峰。為血清蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步深入研究提供了一種經(jīng)濟(jì)、簡便的血清清蛋白去除方法。
　　 實驗進(jìn)一步建立了血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究中HPLC指紋圖譜方法學(xué),對流動相、柱溫、檢測波長、共有峰及內(nèi)標(biāo)的選擇問題進(jìn)行了研究,并以相對保留時間和相對峰面積為參數(shù)分析了方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度。結(jié)果顯示,在所建立的條件下,內(nèi)標(biāo)峰的色譜保留時間約為23分鐘,峰型清晰對稱,與樣品中的其他蛋白分離完全。在健康對照組色譜圖中

7、,篩選出11個共有峰,以相對峰面積為參數(shù)分析了方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度,其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別<5.64％、<4.79％、<2.94％,并初步發(fā)現(xiàn)健康體檢者與肺癌患者譜圖存在差異。
　　 最后在批量樣本中驗證了肺癌患者、肺炎患者、健康體檢者經(jīng)上述建立的HPLC指紋圖譜方法分離后的譜圖差異。選取性別年齡與肺癌患者匹配的41例健康體檢者及14例肺炎患者,非小細(xì)胞肺癌患者并排除其他疾病患者50例,應(yīng)用乙腈沉淀技術(shù)去除血清清蛋白等HAP