魷魚(Todarodes Pacificus)內(nèi)臟自溶液的體外抗氧活性及內(nèi)源性蛋白酶的提取和應(yīng)用.pdf

1、魷魚內(nèi)臟是魷魚加工過程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物，占整個魚體濕重的15％左右。大型魷魚加工企業(yè)對魷魚內(nèi)臟處理方式為制成魷溶漿后低價(jià)出售，而小型加工企業(yè)普遍處理方式為就地掩埋。這些處理方式不僅未充分挖掘出魷魚內(nèi)臟的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而且也不利于當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境，不符合我國可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略。本論文針對魷魚內(nèi)臟開發(fā)利用現(xiàn)狀，在前期完成魷魚內(nèi)臟抗氧化型自溶液(SVAs)的基礎(chǔ)上，主要開展以下研究:(1)魷魚內(nèi)臟自溶液的營養(yǎng)評價(jià)以及體外抗氧化活性研究;(2)利用常見的

2、分離純化技術(shù)方法，提取鑒定了魷魚內(nèi)臟自溶液抗氧化肽，并分析了各個肽段的抗氧化活性;(3)研究了利用ISP法提取魷魚內(nèi)臟蛋白酶的最優(yōu)條件，并通過質(zhì)譜技術(shù)對獲得的蛋白酶進(jìn)行了鑒定;(4)對魷魚內(nèi)臟蛋白酶的部分理化性質(zhì)進(jìn)行了研究，包括酶的最適溫度和最適pH，酶對溫度、pH以及鹽度的耐受性;同時，利用魷魚內(nèi)臟蛋白酶水解黃鯽魚魚肉蛋白，分析了水解液的體外抗氧化活性。
　　魷魚內(nèi)臟自溶液的營養(yǎng)評價(jià)說明SVAs的蛋白提取率和可溶性肽含量高，達(dá)到

3、了78.47％，氨基酸組成合理，含量最高的氨基酸為谷氨酸，達(dá)到了37.18 mg/g，第一限制氨基酸是蛋氨酸+半胱氨酸，其余必需氨基酸含量均高于FAO/WHO的推薦值。SVAs的體外DPPH自由基和羥自由基清除能力以及還原力要強(qiáng)于同濃度的L-肌肽，有進(jìn)一步開發(fā)為功能型風(fēng)味肽的應(yīng)用前景。
　　采用Sephadex G25凝膠層析和RP-HPLC分離對SVAs進(jìn)行分離純化，其中凝膠過濾層析得到SVAs1，SVAs2，SVAs3和SVA

4、s4組分，其中SVAs3的體外抗氧化活性最好;通過LC-ESI-MS/MS技術(shù)從SVAs3中鑒定得到六條抗氧化肽SVAs3-Ⅰ(LLAPPER)、SVAs3-Ⅱ(FPGLADR)、SVAs3-Ⅲ(WVAPLK), SVAs3-Ⅳ(FFNPVH),SVAs3-Ⅴ(FNVVLK)、SVAs3-Ⅵ(LELPLK)。化學(xué)合成的上述六條肽均顯示了一定的體外抗氧化活性，其中SVAs3-Ⅳ和SVAs3-Ⅴ對DPPH自由基清除效果最強(qiáng)，SVAs3-Ⅲ和

5、SVAs3-Ⅳ的清除羥自由基的效果最好，而SVAs3-Ⅳ的還原力最高。
　　采用ISP法提取魷魚內(nèi)臟蛋白酶，確定ISP法提取魷魚內(nèi)臟蛋白酶的最佳pH為3.0，經(jīng)超濾后酶活達(dá)到1.06U/mL，比酶活達(dá)到8.83U/mg，與粗酶液相比，純化了3.96倍，蛋白回收率為54.55％。SDS-PAGE顯示純化的酶液中至少含有兩種蛋白，分子量分別為45kDa和28.06kDa，而酶譜圖顯示純化的酶液至少含有一種蛋白酶，分子量為45kDa;

6、UPLC-ESI-MS/MS表明，提取的魷魚內(nèi)臟蛋白酶為組織蛋白酶D[Todarodes Pacificus]，分子量為42.748kDa。
　　對魷魚內(nèi)臟蛋白酶的理化性質(zhì)研究表明，魷魚內(nèi)臟蛋白酶的最適溫度為60℃，最佳pH為3.00，該酶在30～50℃，pH1.0～5.0范圍內(nèi)酶活性穩(wěn)定。此外，該酶在NaCl濃度為8％時孵育60min后，其酶活保持80％以上，具有較好的耐鹽性。將魷魚內(nèi)臟蛋白酶用于水解黃鯽魚，結(jié)果表明:當(dāng)黃鯽魚水