肝纖維化和肝硬化患者肝內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α水平的變化.pdf

1、盡管肝移植是目前治療終末期肝病最有效的手段，但由于供體短缺、免疫排斥和費(fèi)用支出高昂等問題，使得肝移植的運(yùn)用受到了一定的限制。骨髓干細(xì)胞中可以分化形成肝細(xì)胞的這個(gè)特定干細(xì)胞群，被稱之為骨髓衍生肝干細(xì)胞（Bone marrow derived liver stem cells，BMDLSC）。這類干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，為肝臟疾病治療提供了新思路和新手段。小鼠BMDLSC移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BMDLSC對(duì)CCL4及酒精所致小鼠肝纖維化具有逆轉(zhuǎn)作用。性別交叉

2、設(shè)計(jì)的肝移植及骨髓移植實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，損傷肝對(duì)內(nèi)源性BMDLSC具有招募作用，但是，招募BMDLSC向肝臟移居的具體物質(zhì)尚未完全明了。 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（Stromal-Derived Factor-1α，SDF-1α）是一種可趨化CXCR4陽性的骨髓源性干細(xì)胞的細(xì)胞因子。正常肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞和發(fā)生炎性損傷或排斥反應(yīng)的肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞均可表達(dá)SDF-1α。2002年，Hatch等首先利用小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)在肝內(nèi)表達(dá)的SDF-1α可趨

3、化CXCR4陽性CD34+造血干細(xì)胞（HSCs）入肝，并參與激活HSCs分裂增殖及向肝樣細(xì)胞分化，對(duì)損傷較為嚴(yán)重的肝臟進(jìn)行修復(fù)[2]。另外，肝卵圓細(xì)胞（HOCs）也可分泌SDF-1α分子，同時(shí)又可表達(dá)CXCR4受體。SDF-1α通過自分泌/旁分泌機(jī)制調(diào)節(jié)HOCs發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。在肝再生過程中，SDF-1α的表達(dá)上調(diào)以及SDF-1α與CXCR4的相互作用可激活靜止的卵圓細(xì)胞使其增殖，并在其他細(xì)胞因子（如SCF、HGF等）的共同參與作用下，

4、誘導(dǎo)HOCs向肝細(xì)胞或膽管上皮細(xì)胞分化，修復(fù)肝組織。 SDF-1α在人肝內(nèi)的表達(dá)情況尚未見報(bào)導(dǎo)，慢性肝病患者由肝炎后肝纖維化向肝硬化發(fā)展的進(jìn)程中，SDF-1α的表達(dá)變化也不清楚。 本文采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)肝纖維化及肝硬化患者肝內(nèi)SDF-1α的表達(dá)水平。方法參照人SDF-1α ELISA試劑盒內(nèi)所附的操作說明。由于當(dāng)前的人SDF-1α E

5、LISA試劑盒主要用于測(cè)定血清中的SDF-1α濃度，因而對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行改進(jìn)，具體的改進(jìn)包括，將收集到的肝組織標(biāo)本稱量后充分勻漿，加入一定比例的PBS緩沖液稀釋，再兩次低溫高速離心后提取上清液進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)結(jié)果顯示，肝纖維化組SDF-1α水平顯著高于正常對(duì)照組和肝硬化組，而正常對(duì)照組和肝硬化組比較無顯著性差異?！　?材料和方法：　　 1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象30例病人，他們于2007年9月至2008年3月在南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院肝膽

6、外科接受肝臟手術(shù)包括肝移植，其中男性23例，女性7例，年齡22～72歲，平均48歲。30例病人共分為3組： ①正常對(duì)照組（n＝8）：乙肝表面抗原陰性，實(shí)驗(yàn)室檢查顯示肝功能正常，Child-Pugh肝功能分級(jí)評(píng)估為A級(jí)，肝組織病理學(xué)檢查顯示肝組織結(jié)構(gòu)正常。 ②肝纖維化組（n=10）：有乙型肝炎病史，乙肝表面抗原陽性，實(shí)驗(yàn)室檢查顯示肝功能正常或異常，Child-Pugh肝功能分級(jí)評(píng)估為A級(jí)，組織病理學(xué)檢查顯示肝內(nèi)纖維化組織增

7、生，但無假小葉形成。 ③肝硬化組（n=12）：有乙型肝炎病史，乙肝表面抗原陽性，肝功能檢查輕度至重度異常，Child-Pugh肝功能分級(jí)評(píng)估為A～C級(jí)，病理學(xué)檢查顯示肝內(nèi)廣泛纖維組織增生，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，假小葉及再生結(jié)節(jié)形成?！　?2.觀察指標(biāo)與方法。 2.1 臨床癥狀與體征體查確認(rèn)患者有無黃疸，有無肝掌與癡蛛痣，有無腹腔積液，有無肝性腦病，以及這些癥狀體征的程度。 2.2　影像學(xué)檢查: 行肝臟CT掃

8、描和肝臟腹腔B型超聲檢查。 2.3 實(shí)驗(yàn)室檢查: 行乙肝兩對(duì)半、丙肝抗體試驗(yàn)，術(shù)前3d內(nèi)抽血化驗(yàn)肝功能指標(biāo)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、白蛋白（ALB）、白球比（A/G）、血清總膽紅素（TBIL）、間應(yīng)膽紅素（IBIL）、凝血酶原時(shí)間（PT）。 2.4 組織病理學(xué)檢查肝組織經(jīng)固定、石蠟包埋、脫蠟至水及HE染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察。 2.5 SDF-1α濃度的測(cè)定。 2.

9、5.1 肝組織的勻漿、離心精確稱重肝組織后移入微量手動(dòng)玻璃勻漿器中于低溫環(huán)境中徹底勻漿，按比加入1×PBS緩沖液將勻漿組織洗下并轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管中，在低溫高速離心機(jī)中以4℃、10000×g離心力離心15min，提取上清液移至另一1.5ml EP管中，再次于4℃下10000×g離心10min，取上清液待測(cè)。 2.5.2 ELISA法測(cè)定SDF-1α濃度 按照試劑盒的操作說明進(jìn)行。采用雙抗體夾心ELISA法，即將SDF-1α

10、與包被于酶標(biāo)板上的單抗結(jié)合后，再結(jié)合生物素化的抗人SDF-1α，加入OPD進(jìn)行顯色，在酶標(biāo)儀上讀取492nm及620nm的雙波長(zhǎng)OD值，SDF-1α濃度與OD值成比，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行曲線估計(jì)，得到擬合效果最佳的標(biāo)準(zhǔn)曲線后，再計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，最后求出標(biāo)本離心液中的SDF-1α濃度：加樣→37℃反應(yīng)120min→洗板4-6次，拍干→加入生物素化的抗人SDF-1α→37℃反應(yīng)120min→洗板4-6次，拍干→加入HRP-Strept

11、avidin→37℃反應(yīng)60min→洗板4-6次，拍干→加入OPD顯色液→37℃暗反應(yīng)10min→滴加終止液→讀取OD值?！　?3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 最終數(shù)據(jù)均以x±S表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。行×列表資料采用X2檢驗(yàn)；多組均數(shù)方差齊同，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）；多組均數(shù)方差不齊，采用Welch近似方差分析及Dunnett's T3兩兩比較；相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)，標(biāo)

12、準(zhǔn)曲線制作應(yīng)用曲線估計(jì)。所有統(tǒng)計(jì)分析中，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。　　 結(jié)果：　　 1.SDF-1α與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果。 1.1 分組相關(guān)：①正常對(duì)照組，SDF-1α與AST、ALT、ALB、IBIL均無顯著性的相關(guān)關(guān)系；②肝纖維化組，SDF-1α與AST、ALT、IBIL呈顯著性正相關(guān)，而與ALB的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；③肝硬化組，SDF-1α與各指標(biāo)均無顯著相關(guān)性。 1.2 總體相關(guān)：對(duì)所有樣

13、本進(jìn)行相關(guān)分析，SDF-1α與AST、ALT、ALB、IBIL均無顯著相關(guān)性。　　 2.正常對(duì)照組、肝纖維化組、肝硬化組的SDF-1α水平分別為（5.18±1.90）、（18.94±7.05）和（4.79±1.86）pg/mg。肝纖維化組的SDF-1α水平顯著高于正常對(duì)照組和肝硬化組，而正常對(duì)照組和肝硬化組的SDF-1α水平無顯著性差異。 結(jié)論： 1.肝內(nèi)SDF-1α水平與肝功能指標(biāo)的相關(guān)分析結(jié)果顯示，正常對(duì)照組

14、和肝硬化組的肝內(nèi)SDF-1α水平與肝功能指標(biāo)的變化無顯著相關(guān)性，僅肝纖維化組的肝內(nèi)SDF-1α水平與肝功能指標(biāo)的變化呈顯著性正相關(guān)，表明肝內(nèi)SDF-1α水平的變化與肝臟的功能狀態(tài)不一致，與肝功能指標(biāo)的變化不呈比例?！　?2.肝纖維化組的肝內(nèi)SDF-1α水平顯著高于正常對(duì)照組和肝硬化組，而肝硬化組與正常對(duì)照組的肝內(nèi)SDF-1α水平無顯著性差異，表明肝臟表達(dá)SDF-1α的數(shù)量與肝臟損傷的程度并不一致，在肝纖維化階段，肝臟表達(dá)SDF-