MiR29a-b1在鋁致Aβ沉積過程中的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　1.探討麥芽酚鋁暴露對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞miR-29a、miR-29b1、BACE1和Aβ1-42表達(dá)的影響；
　　2.通過建立高表達(dá)miR-29a或miR-29b1的細(xì)胞模型，進(jìn)一步探討miR-29a和miR-29b1在鋁致Aβ沉積過程中對BACE1表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。
　　3.通過對神經(jīng)元細(xì)胞體外干預(yù)實(shí)驗(yàn)，探討NF-κB在鋁致miR-29a和miR-29b1異常表達(dá)中的作用。
　　方法：
　　1

2、.取新生24 h內(nèi)的SD大鼠乳鼠的皮質(zhì)進(jìn)行原代神經(jīng)元培養(yǎng)，培養(yǎng)至第三天時加入10μmol/L的阿糖胞苷，應(yīng)用免疫組化法檢測神經(jīng)元特異性表達(dá)蛋白Neuron-specific classⅢβ–Tublin的表達(dá)來進(jìn)行神經(jīng)元純度檢測。應(yīng)用不同濃度麥芽酚鋁染毒大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞，劑量分別為空白對照組（0μmol/L）、低劑量組（20μmol/L）、中劑量組（40μmol/L）、高劑量組（80μmol/L）4組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞和細(xì)胞上

3、液，RT-PCR檢測miR-29a、miR-29b1、BACE1 mRNA表達(dá)水平， ELISA法檢測BACE1蛋白、Aβ1-42含量。
　　2.采用慢病毒感染實(shí)驗(yàn)方法將外源性的miR-29a或miR-29b1轉(zhuǎn)入皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞，以建立高表達(dá)細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)分組分別為：空白對照組、單獨(dú)染鋁組（包括低劑量組（20μmol/L）、中劑量組（40μmol/L）、高劑量組（80μmol/L））、轉(zhuǎn)染陰性組、目的基因轉(zhuǎn)染組，目的基因轉(zhuǎn)染組完成

4、轉(zhuǎn)染后進(jìn)行麥芽酚鋁染毒，分別為轉(zhuǎn)染陽性對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集各組細(xì)胞和細(xì)胞上液，RT-PCR檢測BACE1 mRNA表達(dá)水平，ELISA法檢測BACE1蛋白、Aβ1-42含量。
　　3.培養(yǎng) HEK293細(xì)胞系，并采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將外源性的 miR29a或miR-29b1轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，建立高表達(dá)細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)分組分別為：空白對照組、單獨(dú)染鋁組（包括低劑量組（100μmol/L）、中劑量組（200

5、μmol/L）、高劑量組（400μmol/L））、轉(zhuǎn)染陰性組、目的基因轉(zhuǎn)染組，目的基因轉(zhuǎn)染組完成轉(zhuǎn)染后進(jìn)行麥芽酚鋁染毒，分別為轉(zhuǎn)染陽性組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集各組細(xì)胞和細(xì)胞上液，RT-PCR檢測BACE1 mRNA表達(dá)水平，ELISA法檢測BACE1蛋白、Aβ1-42含量。
　　4.培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞，分別選擇NF-κB激動劑（TPA）和抑制劑（PDTC）對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分組分別為：空白對

6、照組、NF-κB激動劑組（1μM）、NF-κB抑制劑組（50μM）、麥芽酚鋁染毒組（40μM）、麥芽酚鋁+NF-κB抑制劑組，繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集各組細(xì)胞和細(xì)胞上液，RT-PCR檢測miR-29a、miR-29b1、BACE1 mRNA表達(dá)水平，ELISA法檢測BACE1蛋白、Aβ1-42含量。
　　結(jié)果：
　　1.培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞并進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元細(xì)胞純度達(dá)到95％。應(yīng)用不同劑量麥芽酚鋁染毒原代神經(jīng)元細(xì)胞

7、后，隨著染毒濃度的增加，BACE1 mRNA和BACE1蛋白表達(dá)量明顯增加，與對照組相比，中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Aβ1-42水平明顯增加，中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-29a和miR-29b1表達(dá)量不同程度下降，與對照組相比，低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.分別對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29a和miR-29b1后發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染陰性組BACE1 mRNA、BACE

8、1蛋白表達(dá)無明顯變化，轉(zhuǎn)染陽性組BACE1 mRNA、BACE1蛋白表達(dá)下降，但BACE1 mRNA下降無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，BACE1蛋白下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與同等劑量單獨(dú)染鋁組相比，轉(zhuǎn)染后聯(lián)合麥芽酚鋁染毒組BACE1 mRNA、BACE1蛋白表達(dá)下降，低劑量組下降無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中、高劑量組下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染陰性組Aβ1-42水平無明顯變化，轉(zhuǎn)染陽性組Aβ1-42水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與同等劑量單獨(dú)染鋁組相比，轉(zhuǎn)染后

9、聯(lián)合麥芽酚鋁染毒組Aβ1-42水平明顯降低，低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將外源性的miR-29a和miR-29b1分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞36h后，經(jīng)RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-29a和miR-29b1的相對表達(dá)量分別達(dá)到427和480倍，轉(zhuǎn)染完成后麥芽酚鋁染毒24h。其結(jié)果顯示，與空白對照組相比，單獨(dú)染鋁組BACE1 mRNA、BACE1蛋白和Aβ1-42表達(dá)量明顯升高，轉(zhuǎn)

10、染陰性組BACE1mRNA、BACE1蛋白和Aβ1-42表達(dá)量無明顯變化，轉(zhuǎn)染miR-29a各組BACE1 mRNA、BACE1蛋白和Aβ1-42表達(dá)降低，但BACE1 mRNA降低無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，BACE1蛋白和Aβ1-42降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；轉(zhuǎn)染miR-29b1各組BACE1 mRNA、BACE1蛋白和Aβ1-42表達(dá)都降低；與同等劑量單獨(dú)染鋁組相比，轉(zhuǎn)染miR-29a或miR-29b1后聯(lián)合麥芽酚鋁染毒組BACE1 mRNA、BACE

11、1蛋白和Aβ1-42表達(dá)量都明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.對皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞干預(yù)實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，NF-κB激動劑組和單獨(dú)麥芽酚鋁染毒組miR-29a、miR-29b1表達(dá)下降；NF-κB抑制劑組miR-29a、miR-29b1表達(dá)升高，但miR29a升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miR-29b1升高無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與單獨(dú)麥芽酚鋁染毒組相比，麥芽酚鋁染毒聯(lián)合NF-κB抑制劑組miR-29a、miR-29b1表達(dá)升高。與空白對照

12、組相比， NF-κB激動劑組和單獨(dú)麥芽酚鋁染毒組BACE1 mRNA、BACE1蛋白和Aβ1-42表達(dá)量明顯升高；NF-κB抑制劑組BACE1 mRNA、BACE1蛋白和Aβ1-42表達(dá)量降低，但BACE1 mRNA降低無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，BACE1蛋白和Aβ1-42降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與單獨(dú)麥芽酚鋁染毒組相比，麥芽酚鋁染毒聯(lián)合NF-κB抑制劑組BACE1 mRNA、BACE1蛋白和Aβ1-42表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：<