Sphk1在乳腺癌惡性轉(zhuǎn)化過程中作用的初步實驗研究.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文Sphk1在乳腺癌惡性轉(zhuǎn)化過程中作用的初步實驗研究姓名：張彥申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：外科學(xué)(普外)指導(dǎo)教師：姜軍2012-11第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文殖、凋亡及遷移中的作用。通過上述研究以期初步探討S p h k l 在乳腺癌進(jìn)展中的作用，為進(jìn)一步揭示S p h k l 在惡性腫瘤中的生物學(xué)行為提供實驗依據(jù)，為惡性腫瘤的分子靶點的研發(fā)提供新的思路。研究方法和主要結(jié)果：1 ．S p h k l 在人正常乳腺上皮細(xì)胞

2、惡性轉(zhuǎn)化過程中的作用研究。方法：利用化學(xué)致癌劑( D M B A ，二甲基苯葸) 誘導(dǎo)正常的乳腺上皮細(xì)胞( M C F ．1 0 A ) ，在此過程中通過實時熒光定量P C R ( R e a l t i m eQ u a n t i t a t i v eR e v e r s e T r a ns c r i p t i o n - P o l y m e r a s eC h i nR e a c t i o n ，q R T -

3、 P C R ) 的方法檢測誘導(dǎo)后的乳腺上皮細(xì)胞的S p h k l m R N A 的表達(dá)情況，用C C K ．8 和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖和凋亡能力的變化。軟瓊脂克隆形成實驗來檢測誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)化細(xì)胞的惡性能力。結(jié)果：轉(zhuǎn)化后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變，表現(xiàn)為細(xì)胞排列緊密，交織在一起，細(xì)胞大小不一，形態(tài)不規(guī)則，胞核異型性，失去接觸抑制。細(xì)胞中的S p h k lm R N A 表達(dá)水平較未誘導(dǎo)的正常細(xì)胞明顯升高( 氏0 ．0 5 ) 。誘導(dǎo)后的細(xì)胞

4、的增殖能力明顯提高( P < 0 ．0 5 ) ，細(xì)胞凋亡比例降低( 尸< O ．0 5 ) 。D M B A 誘導(dǎo)后的第3 0 代細(xì)胞能在軟瓊脂上形成克隆；對照組細(xì)胞未能形成克隆。2 ．S p h k l 基因?qū)θ巳橄侔㎝ C F ．7 細(xì)胞增殖、凋亡和遷移能力的影響。方法：小干擾R N A ( s i R N A ) 轉(zhuǎn)染M C F ．7 細(xì)胞，以沉默S p h k l 的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率。q R T - P

5、 C R 、W e s t e r nb l o t t i n g ( W B ) 法檢測s i R N A 后，S p h k l 在人乳腺癌M C F ．7 細(xì)胞中的表達(dá)情況，篩選作用效果最明顯的s i R N A 序列及作用時間點。利用C C K ．8 、流式細(xì)胞術(shù)及t r a n s w e l l 法觀測干擾S p h k l 表達(dá)后對乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及遷移能力的影響。結(jié)果：S p h k ls i R N A 轉(zhuǎn)染效率

6、達(dá)8 9 ％。轉(zhuǎn)染s i R N A 后，M C F ．7 細(xì)胞的S p h k lm R N A和蛋白表達(dá)水平均明顯下降，以s i R N A ．2 效果最為顯著( 氏0 ．0 5 ) 。轉(zhuǎn)染S p h k ls i R N A ．2后，M C F 一7 細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯下降，凋亡細(xì)胞比例增加，以上差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義( P < O ．0 5 ) 。結(jié) 論S p h k l 在乳腺癌中發(fā)揮癌基因樣功能，在正常上皮細(xì)胞向癌