運用點擊化學法合成18F標記的靶向腫瘤多肽.pdf

1、正電子發(fā)射斷層顯像(Positron emission tomography，PET)是目前最先進的影像學檢查技術(shù)，是惟一可在活體上顯示生物活動的核醫(yī)學影像技術(shù)，利用正電子核素標記靶向腫瘤的分子，合成PET顯像劑，可用于腫瘤成像以協(xié)助診斷與指導治療等。
　　臨床常用的顯像劑是18F-氟代脫氧葡萄糖（18F-Fluorodeoxyglucose，18F-FDG），其主要反映機體的葡萄糖代謝水平。但部分腫瘤與炎癥等假陽性病變的鑒別診斷

2、欠佳，炎癥病變也會表現(xiàn)為高攝取。
　　為增強顯像劑的靶向性，學者設計了發(fā)夾狀的可激活細胞穿膜肽(Activatablecell penetrating peptide，ACPP)。其發(fā)夾結(jié)構(gòu)由基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)水解底物構(gòu)成，可被惡性腫瘤表面高表達的MMP水解。因此ACPP到達高表達MMP腫瘤細胞表面時，發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)被水解，激活的細胞穿膜肽攜帶放射性核素進入腫瘤細胞，即可用于腫瘤

3、靶向PET成像。
　　除了ACPP，提高腫瘤顯像特異度的方法還有受體顯像。
　　PET受體顯像是利用放射性核素標記的配體與高親和力特異受體靶細胞相結(jié)合，具有配體-受體結(jié)合的高特異性和放射性檢測的高敏感性兩大優(yōu)點。受體顯像分為神經(jīng)遞質(zhì)受體和腫瘤受體兩大類，前者有多巴胺受體等，后者有雌、雄激素和生長抑素受體(Somatostatin receptors，SSTR)等。其中，SSTR是迄今研究與應用最廣的腫瘤受體顯像靶點。

4、　　SSTR是細胞膜表面的一種糖蛋白，分為5種亞型。除廣泛分布于人體正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周組織，多種腫瘤細胞表面也有表達，包括神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤和其他腫瘤（如乳腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌等）。腫瘤組織中的受體數(shù)量與密度比正常組織更多、更高，將放射性核素標記于生長抑素或其衍生物即可用于腫瘤顯像。
　　本研究主要分為兩個部分，第一部分是探討運用點擊化學法18F-FEA標記ACPP的可行性。第二部分是通過點擊化學

5、法，高效、快速合成18F-TEGay標記的生長抑素衍生物TOCA，合成18F-TOCA顯像劑，以用于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(Neuroendocrine tumor，NET)的PET成像。
　　目的:
　　1、合成2-疊氮乙基-4-對甲苯磺酸酯，用于下一步合成18F-FEA輔基:
　　2、合成18F-FEA輔基，用于下一步的點擊反應;
　　3、運用點擊化學反應合成18F-ACPP;
　　4、18F-ACPP標記方法

6、改進和失敗查因;
　　5、合成18F-TEGay輔基，用于下一步的點擊反應;
　　6、運用點擊化學反應合成18F-TOCA，為后續(xù)的生物評價實驗作準備;
　　7、優(yōu)化點擊反應溫度，觀察不同反應溫度對放化產(chǎn)率的影響，得出最佳反應溫度;
　　8、優(yōu)化點擊反應時間，觀察不同反應時間對放化產(chǎn)率的影響，得出最佳反應時間。
　　方法:
　　1、溶于5mL水中的溴乙醇1.25g（10mmol）與疊氮鈉0.78g（1

7、2mmol）加熱至100℃攪拌反應12小時;經(jīng)二氯甲烷25mL、水2×10mL萃取三次;取有機相溶液約25mL，干燥后，加入三乙胺1.417g(2ml，14mmol)，對甲苯磺酰氯1.91g(10mmol)，常溫下攪拌4小時;加入甘氨酸0.15g(2mmol)，攪拌2小時;取有機相溶液，用氫氧化鈉2×50mL(1mol/L)清洗兩次，再次干燥;加熱至40℃旋干溶劑，經(jīng)硅膠柱層析法分離，收集濾過液作氫譜核磁共振檢測。
　　2、18F

8、-FEA的合成:回旋加速器采用核反應18O(p，n)18F得到[18F]氟離子富氧水溶液，將該溶液沖洗QMA柱，[18F]氟離子富集于QMA柱上，再K2.2.2./K2CO3溶液洗脫[18F]氟離子。經(jīng)共沸除水，干燥的[18F]氟離子與2-疊氮乙基-4-對甲苯磺酸酯5mg(4.14nmol)的400μ L無水乙腈溶液，加熱至95℃密封反應10min，85℃下緩慢氮氣流輔助蒸餾15-20min，冰鹽水浴冷卻收集蒸餾液得到18F-FEA。<

9、br>　　3、18F-ACPP的合成:依次加入并混勻抗壞血酸鈉(Sodium L-ascobate，ASC)溶液100μL(1.5mol/L)、CuSO4溶液100μ L(0.45mol/L)和ACPP水溶液500μL(0.28nmol/L)。最后加入前一步合成的18F-FEA，加熱至60℃密封反應15min;
　　4、(1)將ACPP加熱至60℃振蕩反應15min后，采用Radio-HPLC檢測反應情況，驗證其是否會在點擊反應后

10、發(fā)生裂解;
　　(2)點擊反應時間由15min延長至75、110、145min，觀察反應情況;
　　(3)濃縮反應體積，增加反應濃度，更變?yōu)锳SC溶液50μL（3mol/L）、CuSO4溶液50μL(0.9mol/L)和ACPP水溶液100μL(1.4nmol/L)，反應總體積由950μL減少至450μL，觀察反應情況;
　　(4)減少Cu與ASC的用量，更變?yōu)锳SC溶液40μL(0.3mol/L)、CuSO4溶液20

11、μL(0.096mol/L)和ACPP水溶液100μL(1.4nmol/L)，觀察反應情況;
　　(5)加入Cu+穩(wěn)定配體，更變?yōu)锳SC溶液14μL(0.3mol/L)、CuSO4溶液2μL(0.09mol/L)和ACPP水溶液100μ L(1.4nmol/L)，THPTA溶液2μ L(0.45mol/L)，觀察反應情況;
　　5、18F-TEGay的合成:回旋加速器采用核反應18O(p，n)18F得到[18F]氟離子富氧水

12、溶液，將該溶液沖洗QMA柱，[18F]氟離子富集于QMA柱上，再K2.2.2./K2CO3溶液洗脫[18F]氟離子。經(jīng)共沸除水，干燥的[18F]氟離子與TsOTEGay0.16mg(0.455μmol)的280μ L無水乙腈的溶液，加熱至110℃密封反應15 min，得到18F-TEGay。
　　6、18F-TOCA的合成:依次加入并混勻ASC溶液100μL(1.05mol/L)、CuSO4溶液100μL(0.14mol/L)、T

13、HPTA溶液14μL(0.125mol/L)和TOCA溶液200μL(1.75nmol/L)。最后加入前一步合成的18F-TEGay，加熱至60℃密封反應15min，得到產(chǎn)物18F-TOCA;
　　7、點擊反應溫度的優(yōu)化:以50℃、60℃、70℃作為點擊反應的溫度，保持其他反應條件不變，分析反應溫度對18F-TOCA放化產(chǎn)率的影響。
　　8、點擊反應時間的優(yōu)化:以15min、30min、45min、60min作為點擊反應的時

14、間，反應溫度均為70℃，保持其他反應條件不變，分析反應時間對18F-TOCA放化產(chǎn)率的影響。
　　結(jié)果:
　　1、反應得到粗產(chǎn)品，經(jīng)硅膠柱層析法分離，收集濾過液經(jīng)氫譜核磁共振檢測后確認濾過液3為2-疊氮乙基-4-對甲苯磺酸酯。
　　2、18F-FEA標記條件:[18F]氟離子與2-疊氮乙基-4-對甲苯磺酸酯加熱至95℃密封反應10 min后，取少量反應液行HPLC檢測，計算得到合成18F-TEGay的放化產(chǎn)率為98.4

15、％。
　　3、18F-ACPP標記條件:在CuSO4/ASC的催化體系中，ACPP與18F-FEA加熱至60℃密封反應15min后，取少量反應液行HPLC檢測，標記失敗;
　　4、(1)將ACPP加熱至60℃振蕩反應15min后，不會在點擊反應后發(fā)生裂解;
　　(2)點擊反應時間由15min延長至75、110、145min，均未標記成功;
　　(3)濃縮反應體積，增加反應濃度，仍未標記成功;
　　(4)減少

16、Cu與ASC的用量，仍未標記成功;
　　(5)加入Cu+穩(wěn)定配體THPTA，仍未標記成功;
　　5、18F-TEGay標記條件:[18F]氟離子與TsOTEGay加熱至110℃密封反應15 min后，取少量反應液行HPLC檢測，計算得到合成18F-TEGay的放化產(chǎn)率為70％。
　　6、18F-TOCA標記條件:在CuSO4/ASC的催化體系中，TOCA與18F-TEGay加熱至60℃密封反應15min后，取少量反應液

17、行HPLC檢測，計算得到合成18F-TOCA的放化產(chǎn)率為30％，兩步的總放化產(chǎn)率為21％。
　　7、最佳的點擊反應溫度:以50℃、60℃、70℃作為點擊反應的溫度，放化產(chǎn)率分別為17.9％、30.9％、19.2％，即60℃為最佳反應溫度。
　　8、最佳的點擊反應時間:以15min、30min、45min、60min作為點擊反應的時間，放化產(chǎn)率分別為19.2％、17.7％、12.9％、9.6％，即15min為最佳反應時間。

18、r>　　結(jié)論:
　　本實驗第一部分成功合成2-疊氮乙基-4-對甲苯磺酸酯、18F-FEA，但合成18F-ACPP不成功，經(jīng)以上各種改進方法實驗后，18F-FEA標記ACPP的點擊反應均告失敗，考慮失敗原因應為ACPP多肽分子量較大且存在二級結(jié)構(gòu)，均致標記難度較大。
　　實驗第二部分通過兩步一鍋法，應用點擊化學反應，合成新型的靶向神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的生長抑素類PET顯像劑;我們還探索不同反應溫度和時間對點擊反應的影響，得到最佳的點