光點擊化學法構(gòu)建的多功能透明質(zhì)酸納米-微米凝膠用于蛋白質(zhì)藥物的腫瘤靶向高效治療.pdf

1、惡性腫瘤在全世界范圍內(nèi)導(dǎo)致的發(fā)病率逐年上升，目前臨床上治療腫瘤的主要手段包括外科手術(shù)切除、放療、化療等。其中化療是一種常用的治療手段，但腫瘤選擇性差，藥物利用率低，在殺死腫瘤的同時也會對正常組織和器官造成損傷，導(dǎo)致很多病人因強烈的毒副作用而難以堅持化療。蛋白質(zhì)藥物因其高效、高特異性和低毒副作用的特點近年來被越來越多地用于腫瘤治療。盡管蛋白質(zhì)藥物展現(xiàn)出了巨大的潛力，但其臨床應(yīng)用仍受限于在體內(nèi)不穩(wěn)定、容易酶降解以及難以進入腫瘤細胞內(nèi)等缺點。

2、最近，多種納米和微米載體被開發(fā)用來保護蛋白質(zhì)藥物的生物活性和實現(xiàn)蛋白質(zhì)藥物的腫瘤靶向治療。論文第一章介紹了蛋白質(zhì)藥物用于腫瘤治療的現(xiàn)狀，著重概述了用于蛋白質(zhì)包載和控制釋放的各種納米載體和微米載體系統(tǒng)。
　　本論文第二章設(shè)計合成了還原響應(yīng)性自發(fā)熒光的透明質(zhì)酸納米凝膠(HA NGs)用于實現(xiàn)治療性蛋白質(zhì)藥物(細胞色素C(CC)和顆粒酶B(GrB))的高效和高選擇性遞送。該HANGs是用透明質(zhì)酸-胱胺-甲基丙烯酸酯衍生物(HA-Cys-

3、MA)和透明質(zhì)酸-賴氨酸-四唑衍生物(HA-Lys-Tet)經(jīng)反相納米沉淀法和“四唑-烯”光點擊化學交聯(lián)法制備得到。動態(tài)光散射(DLS)結(jié)果顯示HA NGs粒徑較小(150nm)，PDI為0.10，表面帶負電荷(-17.6mV)。HA NGs在生理環(huán)境下和模擬血液環(huán)境中穩(wěn)定，能有效抑制包載的CC蛋白質(zhì)藥物的早釋;而在模擬細胞內(nèi)還原環(huán)境下(10mM GSH)可快速降解，能在10小時內(nèi)快速釋放約80％的CC。而且，從納米凝膠釋放的CC表現(xiàn)出

4、了與自由CC相似的酶催化活性和二級結(jié)構(gòu)。MTT結(jié)果顯示，包載GrB的納米凝膠(GrB-NGs)能夠有效靶向并且殺死CD44過表達的MCF-7乳腺癌細胞和A549肺癌細胞，其IC50比臨床上廣泛使用的化療藥物低了幾千倍。體內(nèi)抗腫瘤實驗表明GrB-NGs在極低劑量(3.8-5.7nmol GrB equiv./kg)時就能有效抑制皮下MCF-7乳腺癌和原位A549-luciferase肺癌的生長，同時不會帶來明顯的毒副作用。該納米凝膠具有高

5、穩(wěn)定性、還原敏感性、良好的腫瘤靶向性和自發(fā)熒光等優(yōu)點，在蛋白質(zhì)藥物的細胞內(nèi)高效遞送方面有很好的應(yīng)用前景。
　　為進一步提高納米凝膠載體的腫瘤選擇性和內(nèi)吞進入腫瘤細胞的能力，本論文第三章設(shè)計了EGFR和CD44雙重靶向的生物響應(yīng)性自發(fā)熒光的透明質(zhì)酸納米凝膠(EGFR/CD44-NGs)用來增強治療性蛋白質(zhì)藥物GrB在卵巢癌和乳腺癌的靶向遞送。EGFR/CD44-NGs由透明質(zhì)酸-四唑衍生物(HA-g-Tet)，透明質(zhì)酸-四唑/GE1

6、1多肽衍生物(HA-g-GE11/Tet)以及透明質(zhì)酸-胱胺-甲基丙烯酸酯衍生物(HA-g-Cys-MA)通過聯(lián)用反相納米沉淀法和“四唑-烯”光點擊化學法制得。EGFR/CD44-NGs可定量包載CC和GrB，粒徑較小(約165nm)，在血清中穩(wěn)定，而在還原條件下快速釋放包載的蛋白質(zhì)藥物。流式結(jié)果顯示EGFR/CD44-NGs內(nèi)吞進入CD44/EGFR高表達的SKOV-3細胞的量是CD44-NGs單靶向?qū)嶒灲M的6倍多。同樣，GrB-EG

7、FR/CD44-NGs相比于GrB-CD44-NGs能更好地激活SKOV-3腫瘤細胞內(nèi)的caspase，更有效地抑制細胞的生長。體內(nèi)抗腫瘤實驗表明GrB-EGFR/CD44-NGs在3.85nmol GrB equiv./kg的低劑量條件下幾乎完全抑制了皮下SKOV-3卵巢癌和MDA-MB-231乳腺癌腫瘤的生長，而且未引起明顯的毒副作用。該治療效果明顯優(yōu)于單靶向的GrB-CD44-NGs。因此，EGFR和CD44雙靶向的多功能透明質(zhì)酸

8、納米凝膠能顯著增強蛋白質(zhì)納米藥物內(nèi)吞進入腫瘤細胞的能力，進而提高蛋白質(zhì)藥物的抗腫瘤效果。
　　腫瘤轉(zhuǎn)移是造成大部分癌癥患者死亡的主要原因。在第四章，用雙靶向EGFR/CD44-NGs包載蛋白質(zhì)藥物皂草毒素(Sap)，并詳細研究了載Sap的納米凝膠(Sap-EGFR/CD44-NGs)對4T1-luciferase(4T1-luc)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的體內(nèi)治療效果。流式結(jié)果顯示EGFR/CD44-NGs內(nèi)吞進入CD44/EGFR高表達的4

9、T1-luc細胞的量是CD44-NGs單靶向?qū)嶒灲M的6.2倍。MTT結(jié)果顯示Sap-EGFR/CD44-NGs能有效地抑制4T1-luc細胞的生長，其半致死濃度(IC50)為5.36nM，這遠遠小于單靶向的Sap-CD44-NGs(14.4nM)。體內(nèi)抗腫瘤實驗表明Sap-EGFR/CD44-NGs在低劑量(13.3nmol Sap equiv./kg)的條件下有效抑制了4T1-luc腫瘤在肺部的轉(zhuǎn)移和生長，并且未表現(xiàn)出明顯的毒副作用。

10、這證明了該雙靶向納米凝膠在包載治療性蛋白質(zhì)藥物后，可高效抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和生長。
　　在第五章，設(shè)計制備粒徑均一的透明質(zhì)酸微凝膠(HMGs)，來實現(xiàn)赫賽汀(Herceptin)在卵巢癌的局部長效釋放。HMGs由透明質(zhì)酸的甲基丙烯酸-2-氨基乙酯衍生物(HA-AMA)和透明質(zhì)酸的二甲氨基四唑衍生物(HA-MTet)經(jīng)微流控法和“四唑-烯”光點擊化學交聯(lián)法制備得到。通過簡單調(diào)節(jié)水相油相速度，可方便制備得到大小均一、粒徑在25-50μm的

11、微凝膠。HMGs在透明質(zhì)酸酶的作用下會降解，并且降解速率隨透明質(zhì)酸酶濃度的增加而加快。HMGs能高效包載Herceptin和IgG蛋白藥物，包載量可高達27.2wt.％。體外釋放實驗表明HMGs可實現(xiàn)Herceptin和IgG的長效可控釋放，在1U/mL的透明質(zhì)酸酶的條件下，Herceptin蛋白藥物在10天時的釋放量為80.6％。圓二色譜(CD)測試顯示從微凝膠中釋放出的Herceptin和IgG蛋白質(zhì)具有與自由蛋白質(zhì)相似的二級結(jié)構(gòu)。