靶向VEGFR-3的多肽TMTP2在惡性腫瘤靶向治療中的應(yīng)用研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　近年來, VEGF-C/VEGFR-3信號(hào)通路在多項(xiàng)研究中被證實(shí)介導(dǎo)實(shí)體瘤周及瘤內(nèi)新生淋巴管生成過程中起重要的作用,該信號(hào)通路是腫瘤淋巴管生成的關(guān)鍵環(huán)節(jié),同時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞的移動(dòng)、浸潤以及轉(zhuǎn)移也起到了非常重要的作用。大量的臨床病理研究表明腫瘤細(xì)胞中VEGF-C或VEGF-D的表達(dá)與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移直接相關(guān)。最近有研究表明,在小鼠黑色素瘤模型中利用重組腺相關(guān)病毒的基因治療方法表達(dá)可溶性VEGFR-3可阻斷淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移

2、。這些研究結(jié)果提示,阻斷VEGFR-3信號(hào)通路能有效抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,也有可能降低遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的發(fā)生率。所以,基于該通路在腫瘤轉(zhuǎn)移以及淋巴管生成過程的重要性,阻斷該信號(hào)途徑的相關(guān)研究有望成為抗腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移治療新的有效手段。
　　在前期的研究中應(yīng)用新型細(xì)菌鞭毛展示隨機(jī)肽庫技術(shù)對(duì)重組活性蛋白VEGFR-3的胞外區(qū)進(jìn)行篩選,經(jīng)體外驗(yàn)證測(cè)序獲得一段5肽序列,命名為“TMTP2”;本研究擬選擇腫瘤淋巴管及淋巴管生成為研究靶點(diǎn),通過建立體內(nèi)外淋

3、巴管生成及腫瘤相關(guān)模型來探討驗(yàn)證TMTP2與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的靶向識(shí)別效應(yīng),以及對(duì)淋巴管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移的靶向阻遏效應(yīng);旨在為多肽載體的應(yīng)用帶來新的理論依據(jù)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),如能進(jìn)而利用該多肽載體攜帶化療藥物進(jìn)行靶向腫瘤淋巴管生成與轉(zhuǎn)移的治療,則有望提供一個(gè)早期診斷轉(zhuǎn)移和控制腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的多肽藥物,為腫瘤的分子治療帶來新的契機(jī)和希望。
　　方法：
　　通過體外三維培養(yǎng)的方法建立淋巴管體外成管模型,再通過相關(guān)的軟件分析體外形成的管樣結(jié)

4、構(gòu)進(jìn)行分析;在C57BL/6小鼠角膜微袋中移植TC-1細(xì)胞相應(yīng)腫瘤,通過HE染色及免疫熒光的方法檢測(cè)腫瘤及腫瘤淋巴管的新生;在BALB/c小鼠乳腺皮下脂肪墊處注射小鼠來源的乳腺癌4T1細(xì)胞,建立自發(fā)性肺及其他器官的轉(zhuǎn)移模型,2-3周分別取肺組織于體視顯微鏡下觀察,并且通過HE染色進(jìn)一步驗(yàn)證;在BALB/c裸鼠的乳腺原位脂肪墊皮下注射人類乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231建立乳腺癌異種移植模型,通過染色觀察腫瘤內(nèi)部淋巴管的生成及轉(zhuǎn)移情況。通

5、過尾靜脈注射或者顯微注射的方法將帶有熒光標(biāo)記多肽注射到小鼠或者斑馬魚的體內(nèi),不同時(shí)間點(diǎn)取下組織,利用免疫熒光的方法檢測(cè)多肽的分布及靶向情況。通過建立乳腺癌原位移植模型、角膜微袋腫瘤生長模型及模式生物-斑馬魚,檢測(cè)TMTP2在新生淋巴管生成過程中的靶向識(shí)別作用,通過尾靜脈注射或者顯微注射的方法將帶有熒光標(biāo)記多肽注射到小鼠或者斑馬魚的體內(nèi),不同時(shí)間點(diǎn)取下組織,利用免疫熒光的方法檢測(cè)多肽的分別及靶向情況。利用上述模型體內(nèi)驗(yàn)證多肽TMTP2-D

6、KK對(duì)上述模型的腫瘤及淋巴管新生的靶向阻遏作用。體外先對(duì)4T1細(xì)胞進(jìn)行不同濃度多肽TMTP2-DKK的處理,再通過Transwell試驗(yàn)驗(yàn)證多肽TMTP2-DKK處理后的細(xì)胞對(duì)遷移侵襲的影響;在構(gòu)建的乳腺癌轉(zhuǎn)移模型中驗(yàn)證多肽TMTP2-DKK在體內(nèi)對(duì)轉(zhuǎn)移的抑制效應(yīng);顯微鏡觀察計(jì)算多肽處理后的小鼠肺部的轉(zhuǎn)移灶,HE染色進(jìn)一步驗(yàn)證其轉(zhuǎn)移灶的組織結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：
　　與空白對(duì)照組對(duì)比,HLEC體外三維培養(yǎng)6h后,VEGF-C融合

7、蛋白組中形成更多的管腔樣結(jié)構(gòu),隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,最后形成復(fù)雜的閉合三維淋巴管網(wǎng);角膜微袋腫瘤移植的小鼠從第5天出現(xiàn)肉眼可見的血管新生的變化,由7天直至14天血管生長更加明顯;在BALB/ C小鼠4T1乳腺癌轉(zhuǎn)移模型中,在腫瘤細(xì)胞移植4周后所有被種植的小鼠均發(fā)生較大的原發(fā)腫瘤,同時(shí)在肺部可見多個(gè)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié);小鼠乳腺癌原位異種移植模型也可見皮下瘤不同程度的生長;TMTP2對(duì)LEC細(xì)胞有很好的親和效應(yīng),在實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞胞漿內(nèi)可見很強(qiáng)的綠色熒光,

8、也有部分細(xì)胞核內(nèi)也有較強(qiáng)的熒光,而在對(duì)照肽組只有藍(lán)色的核染色之外,沒有其他的熒光;在小鼠的乳腺癌及全角膜的切片中均可見較強(qiáng)的多肽表達(dá)熒光,而在錯(cuò)序?qū)φ针臒o相關(guān)的熒光表達(dá);同樣在斑馬魚的胸導(dǎo)管內(nèi)也有綠色熒光的分布;在體外成管試驗(yàn)中,未處理組與添加了VEGFC組都有明顯的管狀結(jié)構(gòu)形成,而TMTP2-DKK及TMTP2-DKK+VEGFC處理組成管均明顯減少,錯(cuò)序肽以及TMTP2則對(duì)成管沒有抑制作用;在乳腺癌的荷瘤小鼠中,TMTP2-DKK處

9、理組的腫瘤體積明顯小,瘤體重量明顯較對(duì)照組輕,且內(nèi)部淋巴管的數(shù)目也較對(duì)照組少;在TMTP2-DKK處理組的角膜成瘤整體要比對(duì)照組小,且組化結(jié)果淋巴管的數(shù)目明顯少于對(duì)照組;在斑馬魚的試驗(yàn)中,與對(duì)照組相比,TMTP2-DKK處理后發(fā)生明顯的心包水腫及胸導(dǎo)管分離,高倍視野下觀察到斑馬魚胸導(dǎo)管缺失;在體外Transwell試驗(yàn)中,與對(duì)照組相比,TMTP2-DKK處理組的細(xì)胞穿過率明顯減少;TMTP2-DKK處理組的小鼠腫瘤體積及重量明顯小于對(duì)照

10、組,肺轉(zhuǎn)移率也較對(duì)照組降低;HE染色對(duì)可見肺局部有大量的轉(zhuǎn)移灶;
　　結(jié)論：
　　本研究成功建立了體外三維淋巴管成管模型、體內(nèi)的角膜微袋腫瘤模型、乳腺癌轉(zhuǎn)移模型及裸鼠原位異種移植瘤模型,為淋巴管新生及腫瘤淋巴管生產(chǎn)及相關(guān)信號(hào)通路的研究提供了理想的動(dòng)物模型;多肽TMTP2對(duì)表達(dá)VEGFR-3的LEC及在體內(nèi)腫瘤及相應(yīng)的淋巴管均有很好的靶向識(shí)別效應(yīng);偶聯(lián)DKK后,可以抑制淋巴管的發(fā)生,且可抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移;多肽TMTP2如能與抗腫