牛乳及飼料中三聚氰胺的檢測(cè)方法研究.pdf

1、志賀氏菌屬（Shigella）被劃分到腸桿菌科中，沒有鞭毛和莢膜，革蘭氏染色為陰性桿狀細(xì)菌。志賀氏菌具有很高的傳染性，兒童和老人極易可能接觸到被感染的食品和水而導(dǎo)致痢疾志賀氏菌的侵襲和感染。目前的中國境內(nèi)志賀氏菌已作為首要病原菌引發(fā)感染性腸道不適。因此開發(fā)出志賀氏菌高效、靈敏，方便快捷的新型檢測(cè)法極為重要。
　　日本榮研化學(xué)株式會(huì)Notomi等人在2000年發(fā)明出可以不依賴體內(nèi)環(huán)境的擴(kuò)增核酸片段前沿技術(shù)——環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Lo

2、op-mediated Isothermal Amplification，簡稱LAMP）。本研究采用的實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Real-Time FluorescenceLoop Mediated Isothermal Amplification，簡稱為RTF-LAMP)是對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的改良;其是在LAMP體系中加入了熒光染料SYBR GreenⅠ，SYBR GreenⅠ可以結(jié)合到雙鏈DNA核酸上，結(jié)合后會(huì)發(fā)出比原來增強(qiáng)數(shù)千

3、倍的熒光信號(hào)，將此LAMP反應(yīng)體系放入實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀器進(jìn)行反應(yīng)，通過實(shí)時(shí)檢測(cè)儀的相應(yīng)軟件可觀察反應(yīng)進(jìn)程。該方法可隨時(shí)終止試驗(yàn)，控制反應(yīng)進(jìn)程。
　　本研究最終選取志賀氏菌的ipaH基因?yàn)槟康幕?，利用在線引物設(shè)計(jì)軟件PrimerV4設(shè)計(jì)并選擇與志賀氏菌的ipaH基因相匹配的特異性引物。通過對(duì)反應(yīng)體系中引物的添加量及內(nèi)外引物的比例、Mg2+的添加量、dNTPs的濃度、反應(yīng)溫度、BstDNA聚合酶和熒光染料SYBR GreenⅠ的稀釋倍

4、數(shù)等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立反應(yīng)體系如下:
　　F3與B3各0.2μmol/L，BIP與FIP各1.2μmol/L，dNTPs終濃度5mmol/L，MgCl2終濃度1.5mmol/L。ThermoPol buffer體系中包含20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，10mmol/L KCl,10mmol/L(NH4)2SO4,2 mmol/L MgCl2,0.1％ TritonⅩ-100，終濃度為2.5μl，Bst DNA

5、 polymerase(8U)終濃度1.0μl,提取的志賀氏菌DNA模板加入2.0μl，10000×SYBR GreenⅠ熒光染料最終稀釋500倍，添加量為0.5μl，滅菌ddH2O將體系最終定量到25.0μl。
　　本研究以3株志賀氏菌和19株其他致病菌作為供試菌株，通過對(duì)引物特異性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明只有3株志賀氏菌菌株的檢測(cè)結(jié)果為陽性，其他18株食源性致病菌菌株檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說明本方法檢測(cè)志賀氏菌有較高的特異性，可用于該菌

6、的檢測(cè)。
　　檢測(cè)純菌的靈敏度是4.9CFU/mL，是普通LAMP檢測(cè)方法的10倍;人工污染牛奶的檢出限為7.5 CFU/mL;通過限制性內(nèi)切酶PshAⅠ酶切RealAmp擴(kuò)增產(chǎn)物，測(cè)得酶切片段長度與理論值相符，驗(yàn)證了該反應(yīng)的正確性。
　　通過這個(gè)研究所建立的實(shí)時(shí)熒光環(huán)節(jié)導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)志賀氏菌的方法能夠隨時(shí)監(jiān)測(cè)并直接可以得出檢測(cè)結(jié)果，操作簡單，耗時(shí)短，特異性強(qiáng)、靈敏度高，實(shí)現(xiàn)了志賀氏菌的快速檢測(cè)需要，非常有利于基層檢驗(yàn)檢