L-精氨酸對豬孤雌激活胚胎及體細(xì)胞克隆胚胎發(fā)育的影響.pdf

1、豬體細(xì)胞克隆技術(shù)在畜牧業(yè)遺傳育種和生物醫(yī)學(xué)疾病模型中起著重要的作用。而豬體細(xì)胞克隆還存在較多問題，如克隆效率較低、胎盤發(fā)育異常和克隆胎兒存在生理缺陷等。因此要實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞克隆技術(shù)走出實(shí)驗(yàn)室，服務(wù)于動物生產(chǎn)以及在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，必須改進(jìn)克隆胚胎的生產(chǎn)體系，充分發(fā)揮其發(fā)育潛力。L-精氨酸(L-Arginine,L-Arg)作為條件必需氨基酸，在日糧中補(bǔ)飼可提高自然受孕妊娠母豬生產(chǎn)性能，在體外培養(yǎng)液中添加也有利于豬體外受精胚胎發(fā)育。然而，關(guān)于

2、L-Arg對豬體細(xì)胞克隆胚發(fā)育是否也有積極影響報(bào)道很少。本文探討了在培養(yǎng)基中添加L-Arg對豬孤雌激活胚胎(PAEs)、體細(xì)胞克隆胚胎(NTEs)體外發(fā)育的影響；研究了在日糧中添加L-Arg對移入NTEs的代孕母豬妊娠率、產(chǎn)仔率的影響，具體試驗(yàn)及結(jié)果如下：
　　試驗(yàn)一研究了在卵母細(xì)胞成熟液中添加 L-Arg對豬卵母細(xì)胞體外成熟及早期PAEs發(fā)育的影響。試驗(yàn)組為在卵母細(xì)胞化學(xué)限定性成熟培養(yǎng)基中補(bǔ)充0.12 mM、0.36 mM、0.

3、72 mM、1.08 mM的L-Arg，對照組則采用相同培養(yǎng)基但不補(bǔ)充L-Arg。結(jié)果是相對于對照組，添加L-Arg的各試驗(yàn)組卵母細(xì)胞成熟率，及其來源的PAEs卵裂率、囊胚率和囊胚總細(xì)胞數(shù)均有略微改善，但差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，僅在卵母細(xì)胞成熟階段添加L-Arg，不能有效提高卵母細(xì)胞成熟及著床前胚胎發(fā)育質(zhì)量。
　　試驗(yàn)二探討了在胚胎培養(yǎng)液中添加L-Arg對PAEs發(fā)育的影響。在胚胎培養(yǎng)基中補(bǔ)充0.12 mM、0.36

4、 mM、0.72 mM、1.08 mM的L-Arg作為試驗(yàn)組，采用相同培養(yǎng)基不補(bǔ)充L-Arg的為對照組。我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，添加0.12 mM的L-Arg顯著提高了PAEs的囊胚率和囊胚總細(xì)胞數(shù)(P<0.05)；其它三個試驗(yàn)組也均改善了囊胚率與囊胚總細(xì)胞數(shù)，但是差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果顯示，在胚胎培養(yǎng)階段添加L-Arg，有助于提高著床前胚胎發(fā)育的效率和質(zhì)量。
　　試驗(yàn)三進(jìn)一步探索了在卵母細(xì)胞成熟和胚胎培養(yǎng)階段全程添加L

5、-Arg對豬卵母細(xì)胞體外成熟及其PAEs發(fā)育的影響。以在成熟培養(yǎng)和胚胎培養(yǎng)階段全程補(bǔ)充0.12 mM、0.36 mM和0.72 mM的L-Arg作為試驗(yàn)組，采用相同培養(yǎng)基不補(bǔ)充L-Arg的為對照組。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組的囊胚形成率和對照組相比有改善的趨勢，不過差異并不顯著(P>0.05)；只有添加0.72 mM的L-Arg處理組明顯提高了著床前胚胎的囊胚率(P<0.05)。結(jié)果提示，在卵母細(xì)胞成熟和胚胎培養(yǎng)階段全程添加L-Arg，能提高著床

6、前胚胎的發(fā)育潛力；相對于只在胚胎培養(yǎng)階段添加L-Arg，可能需要更高濃度才能發(fā)揮作用。
　　試驗(yàn)四探索了在胚胎培養(yǎng)不同的時(shí)間段添加L-Arg對PAEs發(fā)育的影響。試驗(yàn)組選擇在胚胎培養(yǎng)的0-168 h、0-72 h和72-168 h補(bǔ)充0.12 mM的L-Arg，對照組采用相同的培養(yǎng)基但不補(bǔ)充L-Arg。試驗(yàn)組的卵裂率、囊胚率和總細(xì)胞數(shù)相對于對照組均有改善，但差異不顯著(P>0.05)。其中0-72 h組改善的趨勢最不明顯，而72-

7、168 h組改善的趨勢最明顯。結(jié)果暗示，L-Arg對豬胚胎早期發(fā)育的影響可能主要發(fā)生在后期。
　　試驗(yàn)五研究了胚胎培養(yǎng)階段添加L-Arg對NTEs早期發(fā)育的影響。試驗(yàn)組在胚胎培養(yǎng)液中補(bǔ)充0.12 mM和0.36 mM L-Arg，對照組不補(bǔ)充L-Arg。相對于對照組，試驗(yàn)組的NTEs的卵裂率、囊胚率和囊胚總細(xì)胞數(shù)均有改善。其中0.12 mM組的囊胚率和囊胚總細(xì)胞數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)。結(jié)果表明，補(bǔ)充L-Arg利于NTEs

8、的體外培養(yǎng)，NTEs的發(fā)育效率及質(zhì)量都可以得到顯著提高。
　　試驗(yàn)六揭示了在代孕妊娠母豬日糧中添加L-Arg對克隆胎兒發(fā)育的影響。在嚴(yán)格執(zhí)行日糧飼喂標(biāo)準(zhǔn)的情況下，分別在試驗(yàn)組22頭移植NTEs的代孕母豬日糧中補(bǔ)充0.8％的L-Arg，在對照組25頭NTEs代孕母豬日糧中補(bǔ)充1.64%的L-丙氨酸（等氮對照）。我們發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組的窩活仔胎盤平均重、窩活仔平均重、窩斷奶前活仔平均重均有提高，雖然差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果暗示，在N

9、TEs代孕母豬日糧中補(bǔ)充L-Arg對NTEs的體內(nèi)發(fā)育存在積極影響，且有利于斷奶前克隆仔豬健康。
　　綜上所述，在胚胎體外培養(yǎng)時(shí)補(bǔ)充0.12 mM L-Arg，無論是PAEs或是NTEs都可以明顯促進(jìn)囊胚形成，并且顯著增加囊胚的總細(xì)胞數(shù)。當(dāng)我們在卵母細(xì)胞體外成熟與胚胎體外培養(yǎng)時(shí)補(bǔ)充0.72 mM的L-Arg，促進(jìn)PAEs的囊胚形成，但囊胚質(zhì)量并沒有得到顯著的改善。在胚胎培養(yǎng)不同時(shí)間段補(bǔ)充0.12 mM的L-Arg都能略微改善PAE