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文檔簡介
1、豬卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)、成熟卵母細胞的孤雌激活和胚胎培養(yǎng)是胚胎生物工程技術(shù)的主要環(huán)節(jié)。研究豬卵母細胞發(fā)育的基礎(chǔ)技術(shù)和相關(guān)機理正逐漸受到人們的關(guān)注。豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)、孤雌激活和胚胎培養(yǎng)條件的優(yōu)化和相關(guān)機理的闡明對于體細胞核移植和轉(zhuǎn)基因動物構(gòu)建具有重要意義。目前,國內(nèi)外在這幾個方面作了相關(guān)的研究,但其研究尚不成熟,影響了我們即將開展的豬體細胞核移植和相關(guān)機理研究的開展。為此,本實驗對豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)、成熟卵母細胞的孤雌激活、孤
2、雌激活胚胎的體外培養(yǎng)和卵母細胞成熟過程中細胞因子的作用以及IGF-Ⅰ促進卵母細胞成熟的機理作了研究,以建立卵母細胞體外發(fā)育的技術(shù)平臺,為轉(zhuǎn)基因豬的研制和豬卵母細胞發(fā)育和克隆相關(guān)機理的研究奠定基礎(chǔ)。 本研究分為4個部分,第一部分對影響豬卵母細胞體外成熟和孤雌激活后胚胎分裂的幾個重要條件進行了比較研究,確立了一種較好的培養(yǎng)方法:與顆粒細胞共培養(yǎng),找到了一種適合豬卵母細胞體外成熟的培養(yǎng)基:mNCSU-23+15IU/mlPMSG+20
3、IU/mlHCG+15%PFF+0.57mM半胱氨酸,成熟率和分裂率分別為(86.7±3.35)%和(86.3±4.16)%,國外報道的最高成熟率為(85.7±4.1)%;第二部分對豬卵母細胞孤雌激活的化學(xué)方法進行了研究,確立了化學(xué)激活豬卵母細胞的兩種最佳方法:1)將成熟的去卵丘顆粒細胞的MⅡ期卵母細胞用20μmol/Lionomycin(離子酶素)作用30min,再將卵母細胞培養(yǎng)于含5μg/mlCB(細胞松弛素)和5mM/L6-DMA
4、P(6-二甲基氨基嘌呤)的NCSU-23培養(yǎng)液中,卵裂率和桑囊胚發(fā)育率達到(76.7±7.6)%和(37.1±6.4)%2)將成熟的去卵丘顆粒細胞的MⅡ期卵母細胞在200μM/L的Thimerosal(乙基汞硫代水楊酸鈉)中處理20min,再與8mM的DTT(二硫蘇糖醇)共孵育30min,卵裂率和桑/囊胚形成率為(81.0±2.8)%和(39.6±2.7)%;第三部分對孤雌激活胚胎的培養(yǎng)條件進行了研究,確立了一種最佳的胚胎培養(yǎng)條件:在S
5、OF簡單培養(yǎng)基中添加顆粒細胞進行前3天的培養(yǎng),然后轉(zhuǎn)入添加胎牛血清的NCSU-23培養(yǎng)基并和輸卵管上皮細胞進行后期的培養(yǎng),其桑椹胚和囊胚的發(fā)育率為(59.5±3.2)%;第四部分研究了IGF-Ⅰ、bFGF、TGF-α三種細胞因子單獨或者聯(lián)合作用對豬卵母細胞體外成熟和孤雌激活后卵裂的影響,并對IGF-Ⅰ促進豬卵母細胞成熟的機理進行了初步探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1)將卵母細胞分別培養(yǎng)于含20ng/ml的IGF-Ⅰ、20ng/mL的bFGF、15ng
6、/mL的TGF-α的NCSU-23中,成熟率和卵裂率最高,分別為[(85.3±2.11)%,(85.4±2.81)%],[(85.0±1.70)%,(85.0±2.82)%],[(86.9±0.46)%,(86.3±2.01)%]2)15ng/mLTGF-α和20ng/mLbFGF聯(lián)用組,卵母細胞成熟率和卵裂率最高,分別為[(89.2±1.44)%,(88.8±0.17)%],IGF-Ⅰ和bFGF、TGF-α有部分擷頏作用,bFGF和T
7、GF-α對卵母細胞的成熟有協(xié)同作用。3)在卵母細胞成熟過程中,添加20ng/mlIGF-Ⅰ組與對照組相比,卵母細胞減數(shù)分裂成熟的時間縮短了,體外成熟的發(fā)育進程加快。4)在未添加IGF-Ⅰ組,Erk1/2激酶在卵母細胞培養(yǎng)過程中的18h開始表達,表達量隨著卵母細胞的成熟不斷增加,在36h達到最大值,此后一直保持穩(wěn)定,直到42h卵母細胞成熟;Akt激酶在卵母細胞成熟的24h開始表達,表達量也隨著培養(yǎng)時間的延長而增加,當36h時侯,表達量達到
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