離心去脂對豬孤雌激活胚胎的影響及機制研究.pdf

1、脂滴一方面作為卵母細胞和早期胚胎發(fā)育過程中重要的能源物質(zhì)，對卵母細胞成熟和胚胎的發(fā)育至關重要;另一方面，由于豬卵母細胞和早期胚胎中脂滴含量非常豐富，對冷凍敏感性極高，因此，豬的卵母細胞和胚胎的冷凍效率一直非常低。研究表明通過機械的離心去脂雖然可以顯著提高豬卵母細胞和胚胎的冷凍效率，但是，部分研究表明去脂會影響胚胎發(fā)育的效率及胚胎的質(zhì)量。不同的研究結果也表明離心去脂對豬胚胎的發(fā)育沒有影響。關于這方面的研究多是通過簡單的觀察統(tǒng)計進行的，而且

2、數(shù)量很少。因此本研究通過對離心去脂胚胎發(fā)育過程中脂滴、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器進行觀察分析，結合細胞內(nèi)能量代謝水平，來系統(tǒng)的揭示離心去脂對豬孤雌激活胚胎發(fā)育的影響及機制。選擇MⅡ期卵母細胞先部分消化透明帶，然后再進行高速離心，之后徹底去除透明帶，孤雌激活后在WOWs培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)到第6天。
　　1、離心去脂顯著降低豬孤雌激活胚胎發(fā)育潛能
　　在胚胎體外培養(yǎng)的24h、36h和144小時，分別統(tǒng)計去脂組和對照組2-細胞、4-細胞和

3、囊胚的發(fā)育效率，通過Hoechst33342染色檢測第6天的囊胚細胞數(shù)。結果發(fā)現(xiàn)去脂組和對照組的2-細胞率和4-細胞率都沒有差異（95.83±2.25％ vs.97.44±0.67％;79.17±4.47％ vs.84.62±1.19％）。去脂組囊胚率顯著低于對照組(21.67±3.78％ vs.49.36±1.77％)，兩組細胞數(shù)沒有顯著差異(37.92 vs.41.88)。
　　2、離心去脂對豬孤雌激活胚胎發(fā)育過程中脂滴的影響

4、
　　收集對照組和去脂組MⅡ期卵母細胞和孤雌激活后12h、24h、36h和144h的1-細胞、2-細胞、4-細胞和囊胚，PFA固定后用油紅O染色。結果發(fā)現(xiàn)去脂組的MⅡ期卵母細胞中，脂滴數(shù)量很少，剩余的大多為小脂滴，且都被極化到了卵母細胞的一邊。在去脂組早期胚胎中（1-到4-細胞），部分脂滴形成了一個環(huán)狀的結果圍繞細胞核分布，其余分布在細胞外周。當胚胎發(fā)育到囊胚期時，無論對照組還是去脂組，脂滴都均勻分布在內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞。去脂組

5、中的脂滴含量從MⅡ卵母細胞到囊胚階段保持不變，但是脂滴的體積在逐漸減小。
　　3、離心去脂對豬孤雌激活胚胎發(fā)育過程中線粒體的影響
　　收集對照組和去脂組MⅡ期卵母細胞和孤雌激活后的1-細胞、2-細胞、4-細胞和囊胚，用MitoTracker Red CMXRos(MTR)染色后PFA固定觀察。結果發(fā)現(xiàn)離心過程中少量線粒體會隨脂滴被離出細胞外，剩余線粒體被極化到卵母細胞的一邊。去脂胚胎發(fā)育過程中線粒體的分布會發(fā)生變化且與對照組

6、分布相同。在1-到4-細胞期間，線粒體主要分布在各卵裂球的外周。但是到囊胚時期時，線粒體均勻的分布在內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞。利用熒光定量PCR檢測mtDNA拷貝數(shù)發(fā)現(xiàn)，從MⅡ卵母細胞到囊胚期的無論哪個時期，對照組和去脂組胚胎的mtDNA拷貝數(shù)都沒有顯著差異。而且在對照組和去脂組中mtDNA拷貝數(shù)都是從MⅡ卵母細胞到4-細胞逐漸降低，隨后與囊胚期保持一致。
　　4、離心去脂對豬孤雌激活胚胎發(fā)育過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的影響
　　收集對照組和

7、去脂組MⅡ期卵母細胞和孤雌激活后1-細胞、2-細胞、4-細胞和囊胚，用ER-TrackerTM Green染色后觀察。結果發(fā)現(xiàn)離心去脂主要影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在MⅡ期卵母細胞中的分布形式。在對照組MⅡ卵母細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)簇被分散分布在整個胞質(zhì)中，離心后被極化到細胞的一邊。在胚胎發(fā)育過程中對照組和去脂組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布相似。1-到4-細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)簇部分分布在卵裂球的皮質(zhì)層，其余的主要分布在細胞核的周圍，形成一個明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光密度環(huán)。在對照組和去脂組的囊

8、胚中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)簇被均勻分布在內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞，而且，可以清楚的看到在內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞中，都會形成明顯的圍核熒光密度環(huán)。通過細胞骨架抑制劑的添加實驗表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在去脂MⅡ卵母細胞到1-細胞期間的恢復主要是微絲介導的。
　　5、離心去脂對豬孤雌激活胚胎發(fā)育過程中ATP的影響
　　收集孤雌激活后的1-細胞、4-細胞和囊胚，利用熒光素酶ATP檢測系統(tǒng)檢測胚胎內(nèi)ATP的含量。結果發(fā)現(xiàn)只有在1-細胞時期，去脂組的ATP含量顯著低于