牛孤雌多倍體胚與克隆多倍體胚胎的研究.pdf

1、在哺乳動(dòng)物中,體細(xì)胞克隆胚胎能夠發(fā)育成個(gè)體的成功率一直很低。即使能夠發(fā)育到妊娠后期,也往往出現(xiàn)胎兒巨大、胎盤異常等現(xiàn)象,從而影響克隆動(dòng)物生產(chǎn)效率。多倍體細(xì)胞主要參與胎盤等胚外組織的形成,將多倍體胚胎與克隆胚胎聚合為一體進(jìn)行移植,可以改善胎盤異常等引起的效率底下現(xiàn)象。因此,多倍體胚胎的研究對(duì)于進(jìn)一步了解克隆動(dòng)物發(fā)育機(jī)理具有重要意義。本研究采用免疫熒光染色、藥物處理、孤雌激活、反向核移植等技術(shù),研究了獲得孤雌多倍體胚胎與克隆多倍體胚胎的技術(shù)

2、途徑、分析了卵母細(xì)胞核的存在對(duì)體細(xì)胞核重編程的影響,以便為進(jìn)一步完善體細(xì)胞克隆技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 1、牛、山羊、綿羊卵母細(xì)胞體外成熟過程中細(xì)胞核和細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)學(xué)變化
　　 在牛、山羊、綿羊卵母細(xì)胞體外成熟過程中,收集成熟不同時(shí)間的細(xì)胞,通過對(duì)紡錘體微管、微絲和染色體的免疫熒光染色,分析了在整個(gè)體外成熟過程中細(xì)胞核的成熟進(jìn)程以及細(xì)胞骨架和染色體的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示:牛和山羊卵母細(xì)胞在成熟培養(yǎng)后的4h開始發(fā)生GVBD

3、,12h即有50％-60％的卵母細(xì)胞到達(dá)MⅠ期,16h到達(dá)AⅠ／TⅠ期峰值(42％),20h后牛和山羊分別有66％和84％的卵母細(xì)胞進(jìn)入MⅡ期；綿羊卵母細(xì)胞核成熟進(jìn)程略慢于牛和山羊,GVBD發(fā)生的時(shí)間也是成熟培養(yǎng)后的4h,但達(dá)AⅠ／TⅠ期峰值的時(shí)間和發(fā)育為MⅡ期的時(shí)間分別為20h(50％)和24h(76.5％),均晚于牛和山羊；卵母細(xì)胞在體外成熟過程中,其細(xì)胞骨架和染色體動(dòng)態(tài)變化在三種動(dòng)物基本相似,在部分綿羊卵母細(xì)胞出現(xiàn)三級(jí)紡錘體等異常

4、結(jié)構(gòu)。
　　 2、細(xì)胞松弛素B(CB)對(duì)牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和二倍染色體卵母細(xì)胞形成的影響
　　 將牛卵母細(xì)胞置入含有CB的培養(yǎng)液中培養(yǎng)后,分別觀察了CB的濃度和處理方法對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育的影響,其結(jié)果是:(1)培養(yǎng)時(shí)間24h(全程處理),CB濃度≥2.0μg／ml時(shí),卵母細(xì)胞的成熟率≤44.8％,成熟卵母細(xì)胞的染色體單倍性組成比例≤73.9％,兩者均顯著低于對(duì)照組的83.1％和93.8％；處理組有50％以上的卵母細(xì)胞未排出第

5、一極體(PB1),其中的50％-65％染色體為60條,呈二倍性；處理的卵母細(xì)胞中出現(xiàn)紡錘體形態(tài)異常、兩個(gè)紡錘體、60條染色體組成超大紡錘體等現(xiàn)象。(2)在培養(yǎng)時(shí)間6-8h分別添加7.5μg／ml和15μg／ml的CB預(yù)處理,然后移到無CB的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至24h,其結(jié)果卵母細(xì)胞的成熟率約為80％,與對(duì)照組的83％沒有顯著性差異,將預(yù)處理時(shí)間延長(zhǎng)到10h使成熟率顯著降低(60％)。(3)在未處理培養(yǎng)液中培養(yǎng)10h,然后轉(zhuǎn)移至含有3.0-

6、7.5μg／mL CB的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)到24h(后處理),結(jié)果只有41.5-7.2％的卵母細(xì)胞排出PB1,其余58.5-92.8％沒有排除PB1。(4)在無CB的培養(yǎng)液中培養(yǎng)10h,然后移至含有7.5μg／ml CB的培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)至24h、30h、36h、48h,進(jìn)行免疫熒光染色,觀察卵母細(xì)胞所處核相,結(jié)果是30h以上處理組AⅠ／TⅠ期卵的比例為1.9-6.4％,顯著低于24h處理組的15.3％,而多數(shù)為由60條染色體組成的巨大紡

7、錘體細(xì)胞。
　　 以上結(jié)果表明,CB可能破壞紡錘體結(jié)構(gòu),從而抑制PB1排出,降低卵母細(xì)胞成熟率,導(dǎo)致二倍染色體(2n或4c)卵母細(xì)胞的形成。
　　 3、細(xì)胞松弛素B(CB)對(duì)牛四倍體孤雌胚胎發(fā)育的影響
　　 將卵母細(xì)胞分為三個(gè)處理組:一是CB濃度為0.1-10.0μg／ml,培養(yǎng)時(shí)間24h的處理組(全程處理組)；二是在含有7.5和15μg／ml CB的培養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)6—10h后移至不加CB的培養(yǎng)液培養(yǎng)至24h(預(yù)

8、處理組)；三是用不加CB的培養(yǎng)液培養(yǎng)10h后轉(zhuǎn)到含有CB的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至24h(后處理組)。然后對(duì)三個(gè)處理組分別進(jìn)行孤雌激活和發(fā)育培養(yǎng),觀察CB對(duì)四倍體孤雌胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果是:(1)后處理組的四倍體孤雌胚囊胚發(fā)育率(25-28％)明顯高于全處理組(5％-15％)、前處理組(7％-16％)和對(duì)照組(12％-16％)。(2)對(duì)后期處理組得到的孤雌胚胎進(jìn)行染色體分析發(fā)現(xiàn),來源于未排PB1的卵母細(xì)胞的胚胎中,有74％的1-細(xì)胞胚胎、82

9、％的2-細(xì)胞胚胎和75％的囊胚是四倍體(4n=120)。(3)對(duì)激活后40h未卵裂的卵母細(xì)胞進(jìn)行染色體分析發(fā)現(xiàn),有15％以上含有超多倍數(shù)染色體,這說明在40h內(nèi)發(fā)生了多次DNA復(fù)制。
　　 以上結(jié)果表明,通過CB處理形成的二倍染色體(2n或4c)牛卵母細(xì)胞,能夠發(fā)育為四倍體胚胎,且發(fā)育率很高。
　　 4、卵母細(xì)胞核的存在對(duì)克隆胚胎供體核重編程和多倍體胚胎發(fā)育的影響
　　 以未去核的MⅡ期卵母細(xì)胞為胞質(zhì)受體構(gòu)建重構(gòu)

10、胚胎,檢測(cè)了卵母細(xì)胞核的存在對(duì)供體細(xì)胞核重編程的影響,包括對(duì)早熟染色體凝集(prematurechromosome condensation.PCC)、染色體結(jié)構(gòu)和重構(gòu)胚發(fā)育的影響,在此基礎(chǔ)上探索了以未去核卵母細(xì)胞構(gòu)建的重構(gòu)細(xì)胞能夠發(fā)育為多倍體的可能性。研究結(jié)果顯示:(1)受體細(xì)胞MⅡ紡錘體的存在更容易誘發(fā)重構(gòu)細(xì)胞中的供體細(xì)胞發(fā)生PCC。(2)供體細(xì)胞核與受體細(xì)胞MⅡ紡錘體之間的位置關(guān)系對(duì)第二極體(PB2)的排出有影響,當(dāng)兩者的紡錘體距

11、離比較遠(yuǎn)時(shí),94.4％的重構(gòu)細(xì)胞能夠排出PB2；當(dāng)兩者的紡錘體位置接近時(shí),幾乎所有重構(gòu)細(xì)胞都沒有排出PB2,大部分(67.9％)形成超大紡錘體,受體卵母細(xì)胞和供體細(xì)胞的染色體混為一體。(3)用去核卵母細(xì)胞構(gòu)建的重構(gòu)胚胎被激活后,其卵母細(xì)胞和供體核顯示出多種原核形態(tài),并且發(fā)育不同步。(4)上述重構(gòu)胚經(jīng)過發(fā)育培養(yǎng)后,以卵丘細(xì)胞為核供體時(shí)卵裂率和囊胚發(fā)育率分別為81.9％和22.3％,與對(duì)照組的84.9％和29.1％沒有顯著差異(p>0.05

12、)；以成纖維細(xì)胞為核供體時(shí)卵裂率和囊胚發(fā)育率分別為90.3％和22.7％,與對(duì)照組的81.9％和31.1％也沒有顯著差異(p>0.05)；而囊胚孵化率則以卵丘細(xì)胞為供體時(shí)0,以成纖維細(xì)胞為供體時(shí)27.5％,分別低于對(duì)照組的23.1％(p<0.05)和72.3％(p<0.05)。(5)以未去核卵母細(xì)胞為受體的重構(gòu)囊胚其細(xì)胞由各種多倍體細(xì)胞混合而成,包括2n／4n、2n／6n、2n／8n和2n／4n／8n；并且這種來源的囊胚細(xì)胞數(shù)(約60個(gè)

13、細(xì)胞)明顯少于去核對(duì)照組的囊胚細(xì)胞數(shù)(約90個(gè)細(xì)胞)。(6)通過反向核移植(reverse nuclear transfer,RNT)的方法研究結(jié)果顯示:重構(gòu)胚融合后1h去核組的囊胚發(fā)育率為47.2％,顯著高于3h去核組的20％。(p<0.01)；重構(gòu)胚融合3h后去核,使染色體構(gòu)象出現(xiàn)異常。
　　 以上結(jié)果表明,卵母細(xì)胞的MⅡ紡錘體能夠誘發(fā)供體細(xì)胞發(fā)生PCC；以去核卵母細(xì)胞為受體構(gòu)建的重構(gòu)胚能夠發(fā)育為囊胚期克隆胚,但其發(fā)育能力明